[發明專利]人C－型利尿鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產品

無效

• 申請號: 200710020890.2
• 申請日: 2007-04-17
• 公開（公告）號: CN101063123A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 金堅;張蓮芬;陳偉;李潔;許正宏;雷楗勇;竇文芳;史仲平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/62;C07K19/00;C12N1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.人C-型利尿鈉肽CNP與人血清白蛋白HSA的融合蛋白的制備方法，其特征是從人血管內皮細胞中提取RNA，通過RT-PCR反轉錄得到CNP?cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSA?cDNA；用重疊PCR技術，連接HSA?cDNA和CNP?cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-CNP?cDNA融合基因插入到克隆載體，HSA-CNP?cDNA融合基因在宿主系統進行表達，HSA-CNP?cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中；

(1)CNP?cDNA的克隆：

以RT-PCR反轉錄得到的CNP?cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增出CNPcDNA，所用的引物如下：

p1：5’-CGGAATTCCACCATGCATCTCTCCCA-3’

p2：5’-AATGCGGCCGCCTAACATCCCAGGCCGCT-3’

PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP?5μl，10×pfu?Buffer?5μl，5U/μl的pfu?DNA聚合酶0.5μl，CNP?cDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為：95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環35次；

通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptII?KS(+)分別經EcoR?I和Not?I雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T₄連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoR?I和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒EcoR?I和Not?I雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質粒命名為pBlue-CNP，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-CNP；

(2)HSA?cDNA的克隆：

利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA?cDNA，所用的引物為：

PH1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’

PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’

PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP?5μl，10×pfu?Buffer?1μl，5U/μl的pfu?DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次；

通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptII?KS(+)分別經SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T₄連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒SalI和HindIII雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA；

(3)HSA?cDNA和CNP?cDNA融合基因的克隆：

HSA?cDNA的PCR擴增，所用引物如下：

P1：5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’

P2：5’-AGCAGCTGGGAGAGATGCATGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAG-3’

PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP?5μl，10×pfu?Buffer?5μl，5U/μl的pfu?DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA?1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次；

CNPcDNA的PCR擴增，所用引物如下：

P3：5’-CAAGTCAAGCTGCCTTAGGCATGCATCTCTCCCAGCTGCT-3’

P4：5’-AATGCGGCCGCCTAACATCCCAGGCCGCTCATGGAGCC-3’

PCR方法如下：50μl的反應體系中加入：10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP?5μl，10×pfu?Buffer?5μl，5U/μl的pfu?DNA聚合酶0.5μl，pBlue-CNP?1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為：95℃變性10分鐘，56℃退火45秒，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環30次；

利用重疊PCR融合CNPcDNA和HSA?cDNA：

將CNP的PCR擴增產物和HSA的PCR擴增產物以體積比1∶1比例混合后作為模板，在50μl的PCR反應體系中加入：2.5mmol/L的dNTP?4μl，10×pfuBuffer?5μl，5U/μl?pfu?DNA聚合酶1μl，混合好的模板2μl，雙蒸水36μl；PCR條件為：95℃變性10min，65℃退火1min，72℃延伸4min30s，94℃變性1min，循環8次后，向反應體系中加入10μmol/L的P1和P4的引物各1μl，循環30次；

通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2.2kb的目標條帶，純化好的目標片段和載體pBluescriptII?KS(+)分別經EcoRI和NotI雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，取雙酶切后純化好的pBlue-HSA-CNP片段5μl，pPIC9K?5μl，加入10×ligation?buffer?2μl，T4連接酶0.4μl，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒EcoRI和NotI酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質粒命名為pBlue-HSA-CNP，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA-CNP；

(4)融合蛋白HSA-CNP的重組酵母構建：

取一支凍存的DH5α/pBlue-HSA-CNP，接種到20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒，提取的質粒pBlue-HSA-CNP和酵母表達載體pPIC9K，分別經EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T₄連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；取雙酶切后純化好的pBlue-HSA-CNP片段5μl，pPIC9K?5μl，加入2μl?10×ligationbuffer，0.4μl?T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取長出菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質粒命名為pPIC9K-HSA-CNP，陽性重組子命名為DH5α/pPIC9K-HSA-CNP；

提取DH5α/pPIC9K-HSA-CNP中的質粒，經SalI酶切后，電擊轉化畢赤酵母KM71，提取重組畢赤酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性重組子命名為KM71/pPIC9K-HSA-CNP；

(5)融合蛋白HSA-CNP的表達：

將KM71/pPIC9K-HSA-CNP接種至裝有100ml?BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養至A_600nm為2～6，離心收集菌體，將收集到的菌體接種至裝有20ml?BMMY的100ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至體積百分終濃度0.5％，誘導3天，離心收集上清，進行SDS-PAGE驗證，Western雜交及放射免疫鑒定融合蛋白HSA-CNP分子的CNP的免疫源性。