[發明專利]含有外周血干細胞的組織工程皮膚及其制備方法

有效

• 申請號: 200710018913.6
• 申請日: 2007-10-19
• 公開（公告）號: CN101138654A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 金巖;張勇杰;陸偉;劉鵬
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學;陜西艾爾膚組織工程有限公司
• 主分類號: A61L27/60
• 分類號: A61L27/60;A61L27/38;A61L27/18
• 代理公司: 中國科學院西安專利中心
• 代理人: 任越

技術領域

本發明屬于生物材料的組織工程技術領域，具體涉及一種含有外周血干細胞的組織工程皮膚的制備方法。

背景技術

皮膚作為人體與外界的屏障具有多種重要功能，由于燒傷、創傷、慢性潰瘍等原因造成的皮膚缺損輕則引起感染，重則可導致脫水、電解質流失以及免疫功能下降乃至死亡等嚴重后果。傳統治療使用的自體皮膚移植存在有很多難以克服的缺點，組織工程皮膚的出現為治療提供了新途徑。目前組織工程皮膚的產品化研究中種子細胞的選擇是關鍵問題之一。體細胞由于在體外增殖速度慢、培養周期長，對于一些難愈性潰瘍的療效不佳，因此尋找合適的種子細胞就成為研究焦點。隨著干細胞研究的進展，能夠從患者自體取材的多種成體干細胞由于其多向分化的特性得到了重視。

外周血中也存在著多種干細胞成分，如造血干細胞、循環成纖維細胞、血管內皮祖細胞、間充質干細胞等。與身體其他部位來源的成體干細胞相比，它們的最大優點是取材方便、對病人造成的痛苦少、不會有病毒感染和免疫排斥等，是較理想的組織工程種子細胞。循環成纖維細胞(Bucala?R，Spiegel?LA，Chesney?J，et?al.[J].Mol?Med，1994，1(1)：71-81)是一類特殊的白細胞亞群，具有造血干細胞的表面標記，有生成和分泌膠原和其他細胞外基質的功能，在體外培養條件下可以分化為成熟的成纖維細胞和肌成纖維細胞。循環成纖維細胞在轉換生長因子β誘導下表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，而α-SMA是肌成纖維細胞的特殊標記，并且它們與膠原生成關系密切。同時循環成纖維細胞能合成分泌血管生成因子，如基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、血管內皮生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子A(PDGF-A)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)和結締組織生長因子(CNTGF)等，能夠促進新血管的形成(Hartlapp?I，Abe?R，Saeed?RW，et?al.[J].FASEB?Journal，2001，15(12)：2215-2224)。除了以上提到的成熟成纖維細胞和肌成纖維細胞，循環成纖維細胞還具有向血管內皮細胞、神經細胞、表皮細胞等多種全層皮膚相關細胞分化的能力(Yong?Zhao，David?Glesne，and?Eliezer?Huberman.PNAS.2003；100：2426-2431)。這更有利于組織工程皮膚產品的血管化、表皮化和皮膚附件的構建。外周血干細胞中的造血干細胞和血管內皮祖細胞等也有利于組織工程皮膚的構建。

隨著對外周血干細胞研究的深入，該細胞在組織重建中發揮的重要作用越來越受到研究者的重視。外周血干細胞的種種特性非常適合作為組織工程產品的種子細胞，參與組織工程皮膚的構建。經檢索，目前尚未見有循環成纖維細胞參與的組織工程皮膚產品及其應用的報道。

發明內容

針對上述狀況，本發明的目的就是提供一種含有外周血干細胞的組織工程皮膚及其制備方法，使所獲得的組織工程皮膚具有防止體液流失、保護創面、改善創面血供并促進創面愈合的功能，適用于修復難愈性皮膚缺損。

本發明所提出的含有外周血干細胞的組織工程皮膚，其特征在于：是由外周血干細胞、皮膚成纖維細胞、表皮細胞和生物支架材料制成，是將外周血干細胞、皮膚成纖維細胞復合于生物支架材料內部，在表面接種表皮細胞構建而成的具有活性的含外周血干細胞的組織工程皮膚。所述的生物支架材料是機體可接受的生物可降解材料，包括膠原、細胞外基質復合物、透明質酸、殼聚糖、硫酸軟骨素、聚乳酸或聚羥基乙酸的任一種或是幾種的混合；其中的細胞外基質復合物包含膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白的成分。所述的外周血干細胞是自體來源的外周血干細胞。所述的皮膚成纖維細胞為自體或是同種異體來源的皮膚成纖維細胞，或是可向皮膚成纖維細胞分化的干細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞。所述的表皮細胞是自體或是同種異體來源的皮膚表皮細胞，或是可向表皮細胞分化的干細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞。

本發明含有外周血干細胞的組織工程皮膚的制備方法，包括有培養基配制、生物支架材料制備、以及組織工程皮膚的三維培養，具體步驟如下，