[發明專利]口蹄疫O、A、Asia－1型三價滅活疫苗

無效

• 申請號: 200710018543.6
• 申請日: 2007-07-23
• 公開（公告）號: CN101130075A
• 公開（公告）日: 2008-02-27
• 發明（設計）人: 王永錄;張永光;方玉珍;蔣守田;劉力寬;潘麗;呂建亮
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: A61K39/295
• 分類號: A61K39/295;A61K39/135;A61P31/14
• 代理公司: 甘肅省專利服務中心
• 代理人: 鮮林

1.一種口蹄疫O、A、Asia-1型三價滅活疫苗，由O型口蹄疫病毒抗原、A型口蹄疫病毒抗原、Asia-1型口蹄疫病毒抗原和佐劑按下述配比制成：

疫苗配制的比例為，抗原∶佐劑＝1∶1；

其中抗原按下述重量百分含量配制：

45％的已滅活并經3倍濃縮的O型病毒抗原O/china/99、20％的A型病毒抗原AF/72和35％的Asia-1型病毒抗原Asia-1/XJ/KLAMY/04混合而成；

佐劑：采用蒙太得206佐劑——Montanide?ISA?206佐劑；

上述原料按照下述工藝方法和順序制備而成：

a、毒種

a.1、O型毒種：牛源O型口蹄疫病毒O/china/99株細胞毒；

a.2、A型毒種：牛源A型口蹄疫病毒AF/72株細胞毒；

a.3、Asia-1型毒種：牛源Asia-1型口蹄疫病毒Asia-1/XJ/KLAMY/04株細胞毒；

b、制苗材料的制備

制苗材料為BHK-21單層細胞，細胞的培養按一般組織培養方法進行；

c、病毒的增殖

用15L轉瓶BHK-21細胞通過濃縮培養法分別增殖制苗用O、A、Asia-1型病毒抗原，轉瓶機轉速為10～12r/h，收獲病毒液，在-15℃下凍結保存；

d、病毒滅活的程序，包括：

d.1過濾；將凍結的0、A、Asia-1型制苗病毒液分別融化，經60～80目銅紗網過濾除細胞碎片，用7.5％NaHCO₃調PH至7.6～7.8，并加200u/mL的青霉素、200μg/mL的鏈霉素；

d.2滅活；向已過濾的O、A、Asia-1型病毒液中分別加入BEI二乙烯亞胺使其濃度達到2mmol/L，在37℃溫室或發酵罐夾套水浴循環升溫至30℃，并在30℃下持續滅活26h，其間每4h搖振1次，滅活終止期加入過濾除菌的50％硫代硫酸鈉溶液，使其終含量為2％，置2～8℃冷庫或發酵罐冰鹽水保溫待檢；

d.3安檢；對O、A、Asia-1型滅活病毒液分別進行安檢，用每型滅活病毒液，頸背部皮下注射2～3日齡乳鼠，0.2mL/只，設對照乳鼠，觀察7d，全部乳鼠不出現口蹄疫癥狀和發病死亡，方為滅活徹底；

d.4菌檢；

對O、A、Asia-1型滅活病毒液分別按《中國獸藥典》進行無菌檢驗；

e.濃縮將O型、A型、Asia-1型制苗病毒液分別物理濃縮3倍；

f、疫苗配制

疫苗乳化，先將油佐劑相真空負壓進料到乳化機內，攪拌過程中，將滅活的病毒液按比例真空負壓進料到油佐劑相中，循環攪拌至抗原與佐劑充分混合后，通過均質機乳化成略帶粘滯性的雙相油乳劑疫苗；

g、疫苗檢驗，包括：

g.1、物理性狀檢查；該疫苗為礦物油乳劑型，外觀呈白色或淡粉紅色略帶粘滯性流體。取一清潔吸管，吸取少許疫苗滴于清潔冷水表面，呈云霧狀擴散；吸取疫苗10mL，加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，水相析出應不超過0.5mL；用1mL吸管(出口內徑1.2mm)吸取25±1℃的疫苗1mL，令其垂直自然流出0.4mL，所需時間應小于或等于8s；

g.2、無菌檢驗；

g.3、安全檢驗

g.3.1用體重350～450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2mL；用體重18～22g的小鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5mL，連續觀察7日，均不應出現因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部反應或全身反應；

g.3.2用至少6月齡的健康易感牛3頭，每頭舌背面皮內注射20個點，每點0.1mL疫苗，逐日觀察至少4d，之后，每頭牛肌肉注射疫苗9mL，繼續逐日觀察6d，均不出現口蹄疫癥狀或明顯的因注射疫苗引起的毒性反應；

g.4、效力檢驗：用至少6月齡的健康易感牛45頭，分為3組，每組15頭。將待檢疫苗分為1頭份、1/3頭份、1/9頭份3個劑量組，每一劑量組分別于頸部肌肉注射15頭牛，接種21d后，將各劑量組免疫牛隨機等分為O型、A型、Asia-1型三個攻毒組，連同對照牛各2頭，分別進行攻毒；O型攻毒組，每頭牛舌上表面兩側分兩點皮內注射牛口蹄疫O型病毒強毒，每點0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；A型攻毒組，每頭牛舌上表面兩側分兩點皮內注射牛口蹄疫A型病毒強毒，每點0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；Asia-1型攻毒組，每頭牛舌上表面兩側分兩點皮內注射牛口蹄疫Asia-1型病毒強毒，每點0.1mL，共0.2mL，含10⁴ID₅₀；連續觀察10d；對照牛至少3蹄出現水泡或潰瘍，免疫牛僅在舌面出現水泡或潰瘍，而其它部位無病變時判為保護，除舌面以外任一部位出現典型口蹄疫水泡或潰瘍時判為不保護；根據免疫牛的保護數，按Karber法計算被檢疫苗的PD₅₀，每頭份疫苗對0型、A型、Asia-1型口蹄疫的免疫效力應至少分別達到3PD₅₀。