[發(fā)明專利]腫瘤靶向性重組新城疫病毒及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710018423.6
• 申請日: 2007-08-07
• 公開（公告）號: CN101205544A
• 公開（公告）日: 2008-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邊惠潔;陳志南;尉丁;李亞琳;張華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 西安文盛專利代理有限公司
• 代理人: 彭冬英

1.具有腫瘤靶向性的重組新城疫病毒，其特征在于：所述的重組新城疫病毒Italien株的病毒基因組，其cDNA是序列表<400>1的序列。

2.如權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向性的重組新城疫病毒構(gòu)建方法，其特征在于：包括下述步驟：(1)分段RT-PCR擴(kuò)增新城疫病毒Italien株的病毒基因組以獲得6個(gè)cDNA亞片段(NPP、PF、FHN、HNL、La、Lb)，然后連接為3個(gè)大片段(NPP、PF+FHN、HNL+La+Lb)，最后連入pBR322載體，得到包含新城疫病毒Italien株全長基因組cDNA的質(zhì)粒pBR-rNDV；輔助表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：用相應(yīng)的引物，PCR分別擴(kuò)增NP和P基因，酶切后克隆到真核表達(dá)載體pCIneo中，獲得質(zhì)粒pCI-NP和pCI-P，L基因則通過用Sac?II/Aal?I雙酶切含L基因的亞基因cDNA片段，然后克隆至pCIneo中，獲得質(zhì)粒pCI-L；體外復(fù)活病毒：將pBR-rNDV、pCI-NP、pCI-P和pCI-L共同轉(zhuǎn)染能夠穩(wěn)定表達(dá)T7?RNA聚合酶的BSR?T7/5細(xì)胞，獲得復(fù)活的重組病毒rNDV；(2)構(gòu)建HN基因與肝癌HAb18?scFv融合表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HNmu/scFv質(zhì)粒：在病毒基因組中HN的開放讀碼框3’端通過G4S?linker連接能夠特異性識別腫瘤抗原的靶向性抗體scFv序列，定點(diǎn)突變HN基因三個(gè)關(guān)鍵氨基酸I175E、R516S和P93G；(3)構(gòu)建包括F末端、F和HN之間的連接序列、EGFP序列以及HN前端序列的質(zhì)粒pUC18/F-EGFP-HN；(4)用HNmu-scFv和F-EGFP-HN片段分別通過酶切替換pBR-rNDV中的HN基因片段和F-HN基因之間相對應(yīng)的片段。

3.如權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向性的重組新城疫病毒，其特征在于：治療基因可以插入質(zhì)粒pBR-rNDV中的NP基因開放讀碼框前、NP和P之間、P和M之間、M和F之間、F和HN之間、HN和L之間以及L之后。