[發明專利]人抗HBsAg單鏈抗體/人抗體輕鏈恒定區/魚精蛋白截短體重組基因、編碼蛋白及應用

無效

• 申請號: 200710018088.X
• 申請日: 2007-06-19
• 公開（公告）號: CN101100671A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發明（設計）人: 楊安鋼;溫偉紅;劉家云;趙晶;王濤;許彥鳴;賈林濤;孟艷玲
• 申請（專利權）人: 楊安鋼
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;A61K48/00;A61K38/16;A61P1/16;C12N15/13;C12N15/12
• 代理公司: 西安文盛專利代理有限公司
• 代理人: 彭冬英

技術領域

本發明涉及生物技術領域的基因治療，具體涉及基因工程方法構建的一種由人抗HBsAg單鏈抗體、人抗體輕鏈恒定區和魚精蛋白截短體的編碼序列組成的重組基因ScFv-Ck-tP，還涉及這種基因編碼的ScFv-Ck-tP融合蛋白，以及由該融合蛋白介導的siRNA、siRNA表達組件(siRNA?expressioncassettes，SECs)或siRNA表達質粒的靶向輸送在抗HBV感染及相關疾病治療中的應用。

背景技術

由乙型肝炎病毒(hepatitis?B?virus，HBV)所引起的乙型肝炎是一種傳播廣泛、危害嚴重的傳染性疾病，也是導致慢性肝病，如肝硬化、肝癌的最常見原因。但是目前的抗HBV及其相關疾病的治療并不讓人滿意，常用的抗HBV的制劑主要有兩大類：α-干擾素和核苷類似物如拉米呋啶(Lamivudine)和阿德福韋(Adefovir)。但是α干擾素的長期有效率僅為30％～40％，而核苷類似物在治療過程中也存在著抗病毒作用短暫、易于誘發DNA多聚酶突變而形成耐藥以及病毒復制水平快速反跳等缺點，因此需要研究和發展高效、特異的抗乙肝病毒藥物。同時，由乙肝病人轉變來的肝硬化、肝癌的治療也非常困難，嚴重威脅人類的健康，也需要開發出高效、特異的治療藥物。????

RNA干涉(RNA?interference，RNAi)是雙鏈RNA介導的、序列特異的轉錄后基因沉默現象。由于它能夠高效特異地關閉或降低特定基因的表達，RNA干涉技術已被廣泛應用于多種疾病的基因治療研究中，并取得了顯著的結果，在乙型肝炎的治療研究中更是取得了令人矚目的結果：體內外實驗都證實了針對HBV的siRNA或siRNA表達質粒都可以高效抑制HBV的基因表達和復制。RNA干涉技術的出現為乙型肝炎的抗病毒治療提供了新的契機，但是，將RNA干涉技術應用于臨床還面臨許多問題，如siRNA或siRNA表達質粒在體內不穩定、細胞攝取率低、無法靶向輸送等。而如何安全有效地將siRNA傳遞至體內靶部位是RNAi應用過程中最關鍵的一個問題。

siRNA或siRNA表達質粒的靶向輸送將為上述問題的解決提供新的手段，特異性地將siRNA或siRNA表達質粒導入靶細胞，而避免對正常細胞的副作用，及大量應用siRNA或siRNA表達質粒時所引起的非特異性免疫反應。目前關于siRNA靶向輸送的研究還處于起步階段，抗體引導的siRNA的靶向輸送是其中最有前景的策略之一。目前基于這一策略的研究報道不多，就所用的抗體分子而言，已有報道的是抗HIV?gp120的Fab抗體和抗HER2分子的單鏈抗體兩種，它們分別針對HIV感染細胞表面的胞膜糖蛋白和腫瘤細胞特異性高表達的HER2分子，它們分別與魚精蛋白形成的融合蛋白可以有效地將siRNA特異性輸送到相應的抗原陽性細胞。其中，由Fab抗體融合蛋白介導的siRNA的輸送效率約為40％，而單鏈抗體融合蛋白的輸送效率為32％。

噬菌體抗體庫技術是近年發展起來的一項分子生物學新技術。它是指利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增出抗體的全套可變區基因，通過噬菌體表面展示技術，把Fab段或單鏈抗體(ScFv)呈現在噬菌體的表面，經過“吸附-洗脫-擴增”過程篩選并富集特異性抗體。該技術為人源性抗體的制備提供了良好的技術平臺，并且逐漸成為目前獲得人源性抗體的主要手段之一。目前，已成功地從這種抗體庫中篩選出針對多種抗原(如病毒和毒素等)的人源性抗體分子。這些抗體分子對于感染性疾病以及腫瘤的診斷和治療具有極為重要的實驗價值，也為新藥的開發和疫苗的研制帶來非常廣闊的前景。

發明內容

本發明的目的是提供一種將具有抗原識別功能的抗體與具有核酸結合功能的魚精蛋白或其截短體融合，構建成同時具有抗原和核酸結合活性的融合蛋白，siRNA與這種融合蛋白結合后，可以在抗體的引導下被特異性地輸送到靶細胞，并隨抗體內化入細胞漿，進入RNAi通路，從而實現對靶基因的高效抑制。