[發明專利]siRNA篩選系統的通用性綠色熒光蛋白融合靶基因表達載體

無效

• 申請號: 200710017857.4
• 申請日: 2007-05-15
• 公開（公告）號: CN101121939A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發明（設計）人: 黃辰;許德暉;劉利英;宋土生
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12Q1/68
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳翠蘭

技術領域

本發明屬生物醫學領域，特別涉及siRNA篩選系統的通用性綠色熒光蛋白融合靶基因表達載體。

現有技術

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)技術是涉及基因功能、基因治療、藥物靶分子篩選等領域的重要研究手段。其中，篩選具有生物活性的小干擾RNA(small?interference?RNA，siRNA)是RNAi技術應用的關鍵步驟。目前，商品化的RNAi篩選系統以lac為報告基因，與靶基因序列重組構建融合基因表達載體。

(1)目前有invitrogen公司開發的商品化的RNAi目標篩選系統-------BLOCK-IT?RNAi目標篩選系統。該篩選系統工作原理為：從任一Gateway中間載體或Ultimate?ORF克隆重組目的基因到pSCREEN-IT/lacZ-DEST?Gateway載體，并使用RNAi抑制試劑進行共轉染。表達基因將與lacZ融合。通過分析檢測β-半乳糖苷酶的活性，將產生的結果與從qRT-PCR獲得的結果進行比較。β-半乳糖苷酶水平是目的基因RNAi誘導降解量的指示劑，β-半乳糖苷酶的水平越低，介導RNAi試劑的效果就越好。該篩選系統的不足之處在于：需要的實驗步驟與實驗試劑過多，不能直接從細胞內檢測到篩選效果，而需要單獨的半乳糖苷酶量化試劑盒，步驟繁多，而且價格昂貴，不適于大面積推廣

(2)Xiu-Min?ZHOU，Ju-Sheng?LIN，Yi?SHI，et?al. Establishment?of?aScreening?System?for?Selection?of?siRNA?Target?Sites?Directed?againstHepatitis?B?V

發明內容

為了克服上述現有技術不足，本發明的目的就是提供siRNA篩選系統的通用性綠色熒光蛋白融合靶基因表達載體，通過檢測熒光強度可以非常方便快速地鑒定相應siRNA序列的沉默效果，從而篩選出最有效的siRNA序列。

本發明的技術方案是這樣實現的：本發明包括該載體以pEGFP-C1載體為基礎，在1336-1363改造SSe8387I和NotI兩個內切酶位點，其載體大小為4695bp，載體命名為pEGFP-RNAi，序列如下：

1????TAGTTATTAA?TAGTAATCAA?TTACGGGGTC?ATTAGTTCAT?AGCCCATATA?TGGAGTTCCG

61????CGTTACATAA?CTTACGGTAA?ATGGCCCGCC?TGGCTGACCG?CCCAACGACC?CCCGCCCATT

121????GACGTCAATA?ATGAGGTATG?TTCCCATAGT?AACGCCAATA?GGGACTTTCC?ATTGACGTCA

181????ATGGGTGGAG?TATTTACGGT?AAACTGCCCA?CTTGGCAGTA?CATCAAGTGT?ATCATATGCC

241????AAGTACGCCC?CCTATTGACG?TCAATGACGG?TAAATGGCCC?GCCTGGCATT?ATGCCCAGTA

301????CATGACCTTA?TGGGACTTTC?CTACTTGGCA?GTACATCTAC?GTATTAGTCA?TCGCTATTAC

361????CATGGTGATG?CGGTTTTGGC?AGTACATCAA?TGGGCGTGGA?TAGCGGTTTG?ACTCACGGGG

421????ATTTCCAAGT?CTCCACCCCA?TTGACGTCAA?TGGGAGTTTG?TTTTGGCACC?AAAATCAACG

481????GGACTTTCCA?AAATGTCGTA?ACAACTCCGC?CCCATTGACG?CAAATGGGCG?GTAGGCGTGT

541????ACGGTGGGAG?GTCTATATAA?GCAGAGCTGG?TTTAGTGAAC?CGTCAGATCC?GCTAGCGCTA

601????CCGGTCGCCA?CCATGGTGAG?CAAGGGCGAG?GAGCTGTTCA?CCGGGGTGGT?GCCCATCCTG

661????GTCGAGCTGG?ACGGCGACGT?AAACGGCCAC?AAGTTCAGCG?TGTCCGGCGA?GGGCGAGGGC