[發明專利]分泌抗人天冬酰胺羥化酶單克隆抗體的雜交瘤細胞制備工藝

有效

• 申請號: 200710017852.1
• 申請日: 2007-05-17
• 公開（公告）號: CN101307302A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發明（設計）人: 薛小平;黃慶生;張明杰
• 申請（專利權）人: 陜西北美基因股份有限公司
• 主分類號: C12N5/18
• 分類號: C12N5/18;G01N33/577
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司
• 代理人: 徐平

技術領域

本發明涉及一種雜交瘤細胞的制備工藝，具體涉及一種可分泌抗人天冬酰胺羥化 酶單克隆抗體的雜交瘤細胞制備工藝。

背景技術

人天冬酰胺羥化酶(HAAH)為α-酮戊二酸依賴雙氧酶，其主要的生物學功能是參與 蛋白質合成過程中翻譯后的蛋白修飾，可催化多種蛋白中含有表皮生長因子(EGF)樣 結構域內的天門冬氨酸和天門冬酰胺殘基的β-碳原子羥基化。

含有表皮生長因子樣結構域的蛋白包括Notch及其配體、凝血因子以及其它具有 重要生物學功能的蛋白，其中Notch及其類似分子與細胞分化有關，特別是其胞內區 與致瘤性密切相關，因此，人天冬酰胺羥化酶與腫瘤的關系引起了科學家的關注，初 步的研究結果顯示人天冬酰胺羥化酶可在膽管癌、肝癌、乳腺癌和結腸癌中高表達， 而正常組織不表達或僅僅是彌散性弱表達。人天冬酰胺羥化酶的作用機制目前還不完 全清楚，現有的結果顯示人天冬酰胺羥化酶是受胰島素和胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)調節的基因，Erk?MAPK和AKT/PKB通路均參與對其表達的調節。在肝癌細 胞系中表達可傳遞胰島素或胰島素樣生長因子-1信號的1型胰島素受體底物 (insulin-receptor?substrate，type1，IRS-1)可增強人天冬酰胺羥化酶的表達， 增強細胞的遷移性以及侵襲性，而表達羥基末端缺失型的1型胰島素受體底物或表達 人天冬酰胺羥化酶的小干擾RNA(siRNA)均可降低人天冬酰胺羥化酶的表達以及降低 細胞的遷移性和侵襲性。胰島素和胰島素樣生長因子-1可在神經母細胞瘤細胞系 SH-Sy5y中也可誘導人天冬酰胺羥化酶表達以及增強細胞的遷移性，Erk?MAPK、AKT 和CDK-5抑制劑則可抑制胰島素樣生長因子-1誘導的人天冬酰胺羥化酶表達以及抑 制胰島素樣生長因子-1誘導的遷移性增強。人天冬酰胺羥化酶在腫瘤細胞表面的表 達，使得瘤細胞的運動性和擴散性顯著地增加，并通過血管和淋巴高管擴散到臨近的 正常組織，最終引起腫瘤的惡性轉化和腫瘤病灶的形成，并成為惡性腫瘤高特異性的 分子標記物。

Lavaissier等在1996年用肝細胞性肝癌(HCC)細胞系FOCUS作為免疫源獲得 單克隆抗體(mAb)FB-50，單克隆抗體FB-50可與可與原代肝細胞性肝癌、轉化細胞 系以及肝細胞性肝癌細胞系高度結合，用單克隆抗體FB-50篩選HepG2細胞的cDNA 文庫獲得的cDNA，經檢測分析，確認為人天冬酰胺羥化酶基因。Ince等在2000年報 道，用人天冬酰胺羥化酶編碼基因轉染NIN—3T3細胞，發現人天冬酰胺羥化酶在 NIH-3T3細胞中過表達，可使細胞表型產生惡性轉化，將這種細胞接種到裸鼠體內可 形成腫瘤，而接種正常細胞無腫瘤形成。報告中數據顯示，人膽管癌細胞人天冬酰胺 羥化酶基因表達陽性率達100％，因其他疾病引起的膽管增生細胞中未檢測到人天冬 酰胺羥化酶基因的表達。Sepe等在2002年報道，人天冬酰胺羥化酶在人原發型惡性 神經外胚層瘤，包括成神經管細胞瘤和神經母細胞瘤過表達，而在正常成熟的腦中人 天冬酰胺羥化酶低水平表達或不能檢出。Palumb等在2002年，對近千例、18種不同 惡性腫瘤標本進行檢測，其中99％人天冬酰胺羥化酶陽性。使用抗人天冬酰胺羥化 酶單克隆抗體(mAb)檢測胰腺癌細胞，18例/19例陽性，而臨近正常胰腺組織均為 陰性。Takashi等2003年在NIH基金支持下研究證實，人天冬酰胺羥化酶過度表達 會促進腫瘤細胞滲透性生長，特異性的反義寡DNA可顯著抑制人天冬酰胺羥化酶表達 并抑制膽管癌細胞的活性。2004年Takashi等報道在50例肝內膽管癌(ICCs)標本 中46例人天冬酰胺羥化酶表達陽性，占92％；12例正常肝細胞和12例原發性硬化 型膽管炎標本人天冬酰胺羥化酶均為陰性。結論為，人天冬酰胺羥化酶是與腫瘤基因 表型相關的關鍵調節蛋白，在調節肝細胞性肝癌細胞的擴散和遷徙中起重要調節作 用，人天冬酰胺羥化酶表達水平高，病人預后差。Feldmann等在2006年用實時定量 PCR檢測了11例膽管癌和5例良性膽管狹窄患者(陰性對照組)標本人天冬酰胺羥 化酶及其同源異型框B7(HoxB7)mRNA水平，結果顯示：檢測敏感性達82％，特異 性80％，常規細胞學方法檢測特異性雖高達100％，但檢測敏感性僅36％。作者認為 人天冬酰胺羥化酶和HoxB7mRNA檢測為膽管癌的診斷提供了非常有價值的工具。到 目前為止，已在在多種腫瘤細胞中檢測到人天冬酰胺羥化酶基因的高表達。Suzanne 等在2006年研究了人天冬酰胺羥化酶在肝細胞性肝癌細胞系細胞和Hep-G2中的表達 調控機理，發現胰島素和胰島素樣生長因子-1通過MAPK和IP3激酶-Akt途徑刺激人 天冬酰胺羥化酶mRNA和人天冬酰胺羥化酶蛋白的表達，過表達的人天冬酰胺羥化酶 顯著增加Hep-G2細胞的運動性和擴散性。用特異性siRNA抑制人天冬酰胺羥化酶基 因表達可顯著地減小肝細胞性肝癌細胞系細胞的定向運動性，他們認為人天冬酰胺羥 化酶是體內調節腫瘤細胞生長的一個重要靶點。Wang等在2007年報道，對130例II 期結腸癌患者標本的人天冬酰胺羥化酶和截斷的人天冬酰胺羥化酶(Humbug)水平做 免疫組化和實時定量RT-PCR檢測，結果顯示人天冬酰胺羥化酶表達陽性為84％，截 斷人天冬酰胺羥化酶表達陽性達94％。作者認為，做為結腸癌預后診斷分子標志物， 截斷人天冬酰胺羥化酶(Humbug)比完整的人天冬酰胺羥化酶特異性更好。