[發(fā)明專利]免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710016328.2
• 申請(qǐng)日: 2007-07-23
• 公開（公告）號(hào): CN101109751A
• 公開（公告）日: 2008-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙玉強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省寄生蟲病防治研究所
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N21/00
• 代理公司: 濟(jì)寧宏科利信專利代理事務(wù)所
• 代理人: 樊慶年;張景宏

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)的方法，尤其涉及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法。

背景技術(shù)：

登革熱和登革出血熱(DF/DHF)是由黃病毒屬的4個(gè)型登革病毒引起的蟲媒病毒病，廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，以東南亞國家最為嚴(yán)重，我國自1978年以來也在海南和廣東沿海一帶發(fā)生了較大的流行。目前檢測(cè)登革病毒感染的方法仍離不開動(dòng)物接種或蚊細(xì)胞培養(yǎng)接種分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用細(xì)胞接種培養(yǎng)分離法檢測(cè)登革病毒是確診流行病菌病菌原較為可靠的方法，但費(fèi)時(shí)、繁瑣，需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件，并且至少1周時(shí)間內(nèi)能出結(jié)果，達(dá)不到早期、快速診斷的目的。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，直接從血液標(biāo)本或媒介蚊體內(nèi)檢測(cè)出登革病毒抗原，做到早期診斷或及早發(fā)現(xiàn)陽性蚊媒，從而控制登革熱的播散。

本發(fā)明所述免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，采用人工經(jīng)口感染蚊蟲DEN-2病毒，分別用細(xì)胞培養(yǎng)接種及蚊頭部壓片免疫熒光法進(jìn)行了檢測(cè)，確認(rèn)埃及伊蚊、白紋伊蚊和C6/36細(xì)胞成功感染了病毒。用蚊頭部壓片免疫熒光技術(shù)，可直接檢測(cè)出蚊體內(nèi)是否攜帶病毒，比細(xì)胞培養(yǎng)和乳鼠接種更為簡便、省時(shí)、敏感。20天內(nèi)均能檢測(cè)出蚊體攜帶病毒的狀況。本發(fā)明所述方法為今后媒介蚊蟲現(xiàn)場監(jiān)測(cè)打下了良好基礎(chǔ)。本發(fā)明所述的免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，取單只飽血感染的白紋伊蚊-20℃凍麻。在解剖鏡下用手術(shù)刀將蚊頭部切下，置于玻片上用解剖針擠壓頭部，使腦內(nèi)物質(zhì)流出、涂勻；晾干后用預(yù)冷丙酮固定10min；滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG；放濕盒內(nèi)；在37℃條件下孵育30min，PBGS洗滌3次，自然晾干后滴加用伊文氏藍(lán)PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC、37℃孵育30min，PBS洗滌，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

采用本發(fā)明所述免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，可以省去病毒分離培養(yǎng)這一步，直接從血液標(biāo)本或媒介蚊體內(nèi)檢測(cè)出登革病毒抗原，無疑可做到早期診斷或及早發(fā)現(xiàn)陽性蚊媒，從而控制登革熱的播散。

附圖說明：

附圖是本發(fā)明所述免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法步驟框圖。1-取野外現(xiàn)場捕捉的埃及伊蚊、白紋伊蚊放在-20℃凍麻2-取一只放在解剖鏡下用手術(shù)刀將蚊頭部切下，置于載玻片上用解剖針擠壓頭部，使腦內(nèi)物質(zhì)流出，涂勻3-晾干后用預(yù)冷丙酮固定10min；滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG，放濕盒內(nèi)；37℃孵育30min，PBGS洗滌3次4-自然晾干后滴加用伊文氏藍(lán)PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC，37℃孵育30min，PBS洗滌，自然晾干5-將載玻片放于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果

具體實(shí)施方式：

現(xiàn)參照附圖，結(jié)合實(shí)施例說明如下：

免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，采用人工經(jīng)口感染蚊蟲DEN-2病毒，分別用細(xì)胞培養(yǎng)接種及蚊頭部壓片免疫熒光法進(jìn)行了檢測(cè)，??確認(rèn)埃及伊蚊、白紋伊蚊和C6/36細(xì)胞成功感染了病毒。用蚊頭部壓片免疫熒光技術(shù)，可直接檢測(cè)出蚊體內(nèi)是否攜帶病毒，比細(xì)胞培養(yǎng)和乳鼠接種更為簡便、省時(shí)、敏感。20天內(nèi)均能檢測(cè)出蚊體攜帶病毒的狀況。本發(fā)明所述方法為今后媒介蚊蟲現(xiàn)場監(jiān)測(cè)打下了良好基礎(chǔ)。本發(fā)明所述的免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)登革病毒的方法，取單只飽血感染的白紋伊蚊-20℃凍麻。在解剖鏡下用手術(shù)刀將蚊頭部切下，置于玻片上用解剖針擠壓頭部，使腦內(nèi)物質(zhì)流出、涂勻；晾干后用預(yù)冷丙酮固定10min；滴加用PBS稀釋的小鼠抗DEN-2病毒IgG；放濕盒內(nèi)；在37℃條件下孵育30min，PBGS洗滌3次，自然晾干后滴加用伊文氏藍(lán)PBS稀釋至工作濃度的羊抗鼠IgG-FITC、37℃孵育30min，PBS洗滌，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蚊蟲體內(nèi)登革病毒試驗(yàn)用材料：

1.蚊蟲

埃及伊蚊、白紋伊蚊為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物學(xué)流行病學(xué)研究所昆蟲養(yǎng)殖室常年飼養(yǎng)的敏感品系。以及野外現(xiàn)場捕捉的蚊蟲。

2.病毒

試驗(yàn)用的DEN-2為New?Guinea?B株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物學(xué)流行病學(xué)研究所提供。乳鼠顱內(nèi)傳代，以細(xì)胞維持液研磨發(fā)病乳鼠腦組織制成10％(w/v)懸液，5000rpm離心15min，取上清用作病毒液備用。

3.C6/36細(xì)胞

來自于白紋伊蚊幼蟲的傳代細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液28℃?CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

4.抗體