[發明專利]一種遲緩愛德華氏菌弱毒活疫苗

有效

• 申請號: 200710015285.6
• 申請日: 2007-07-11
• 公開（公告）號: CN101342367A
• 公開（公告）日: 2009-01-14
• 發明（設計）人: 莫照蘭;茅云翔;肖鵬;李杰;王波;楊佳銀
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;A61K47/04;A61P31/04;C12N1/20
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明為水產養殖動物病害防治技術，涉及水產養殖細菌性疾病的弱毒疫苗，具體的說是一種遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella?tarda)弱毒活疫苗。?

背景技術

遲緩愛德華氏菌是一種革蘭氏陰性致病菌，感染宿主范圍廣，可以感染多種低等和高等動物。在水產養殖動物中，該菌是魚類、兩棲類、爬行類的重要致病菌。由其引起的愛德華氏菌病是水產養殖魚類常見的傳染病，對養殖動物的健康和水產養殖業危害巨大。在我國，已經從養殖的牛蛙、鱉、鰻鱺、牙鲆、大菱鲆、真鯛等多種動物中分離到致病性的愛德華氏菌。?

由于在生產過程中使用各種抗生素進行疾病的防治，已經在世界各地分離到越來越多的愛德華氏菌抗藥性菌株，其中多數菌株呈多重抗藥性，不僅使治療效果下降，而且多種抗藥性菌株和抗藥質粒的存在增加了環境的壓力，對環境造成嚴重的威脅。早在1981年，國際上就成立了世界《慎用抗生素聯盟》，其成員國已達到90多個國家。目前，不少國家已經明令禁止在動物飼料中使用抗生素添加劑。我國加入WTO后，解決抗生素殘留等問題已經刻不容緩。為了減少抗生素對環境的影響，通過免疫途徑防治愛德華氏菌病發生無疑是一種最佳的方式。人們對遲鈍愛德華氏菌的各種疫苗組成(包括滅活菌體細胞苗、脂多糖LPS、去類脂A的多糖、溶血素)和免疫途徑(包括注射、浸泡、口服)進行了大量的工作，但這些滅活疫苗或亞單位疫苗的保護效果都不理想，沒有達到疾病防控的要求。?

遲緩愛德華氏菌的毒力因子有溶血素、軟骨素酶、皮下壞死毒素、過氧化氫酶以及III型分泌系統，這些致病因子參與了細菌的黏附、定殖、侵襲和在動物宿主體內的繁殖和擴散過程。由于遲緩愛德華氏菌可侵入宿主的上皮細胞和吞噬細胞，并在細胞內生長和繁殖。因此作為一種有效的疫苗，只有系統地刺激動物體液和細胞的免疫應答反應才可能達到防治愛德華氏菌病的目的。由于滅活疫苗或亞單位疫苗存在保護抗原不完全、免疫應答反應不全面，尤其是它們主要引起動物的體液免疫應答而不能有效地刺激細胞免疫應答，是疾病防控效果不理想的根本原因；其次是滅活疫苗和亞單位疫苗主要通過注射方式進行魚類免疫，存在勞動力成本高、給藥不方便、容易引起動物應激等副作用。因此到目前為止，還沒有可用的遲緩愛德華氏菌疫苗進入市場。?

弱毒活疫苗對動物具有低毒性，同時能夠有效地激發動物的體液和細胞免疫應答，為動物提供全面的免疫保護，是目前疫苗開發領域的主要發展方向之一；同時以弱毒活疫苗作為表達異源抗原的載體而進行多價疫苗的開發是國際的前沿和熱點。目前，美國專利有利用利福平(rifampicin)培養基對遲緩愛德華氏菌進行多次傳代的方法篩選弱毒株作為弱毒活疫苗(United?States?Patent7067122)，該方法得到的弱毒株遺傳背景不清楚，細菌毒力減弱的機理不明確，在使用時容易造成毒力回復，同時難以對疫苗株進行環境監控。利用轉座子或基因插入失活技術構建的弱毒疫苗攜帶有抗生素和其他外源基因片斷，施用時容易將抗生素和外源基因片斷釋放到環境，存在有基因轉移或整合到其他病原體或其他生物的潛在危險。因此這些弱毒活疫苗難以通過各國的生物制品安全檢察管理機構的審批法規，從而難以實現商品化。?

無標記基因突變技術可以對目的基因進行缺失突變。通過對多個目的??基因的大片段缺失，大大降低了施用時由于毒力回復而帶來的環境傳播危險。同時弱毒株不帶任何外源的抗生素篩選標記和外源基因片段，遺傳背景清晰、毒力減弱機理明確，易于區分疫苗株和野生型菌株，便于對疫苗株進行環境監控，提高疫苗的安全性和可控性。同時，以無標記基因突變弱毒突變株作為疫苗載體表達異源抗原制備多價疫苗具有防治多種傳染病的潛力，因而是目前國際的研究前沿和熱點領域。目前國內外未見利用無標記基因突變技術開發遲緩愛德華氏菌弱毒活疫苗的文獻報道。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種不帶外源抗生素抗性標記和外源基因片段的遲緩愛德華氏菌弱毒活疫苗。?

為實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案為：遲緩愛德華氏菌毒株野生型菌株LSE40的esrB基因缺失弱毒突變株，所述遲緩愛德華氏菌突變株為MZLSE40esrB，其于2007年6月13日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為：CGMCC?No.2087，分類命名：遲緩愛德華氏菌Edwardsiella?tarda，其突變株MZLSE40esrB中不含外源抗生素篩選標記和外源基因片段。?