[發明專利]綠色巴夫藻C20多不飽和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列及應用

無效

• 申請號: 200710015216.5
• 申請日: 2007-06-27
• 公開（公告）號: CN101113454A
• 公開（公告）日: 2008-01-30
• 發明（設計）人: 孔健;牛艷;季明杰;張可煒
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N15/63;C12P7/64
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司
• 代理人: 王緒銀

技術領域

本發明屬于生物技術領域和遺傳工程領域，涉及從一種海洋微藻——綠色巴夫藻(Pavlova?viridis)中克隆C₂₀多不飽和脂肪酸延伸酶基因，具體講是綠色巴夫藻C₂₀多不飽和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列以及將該基因直接或與不同表達載體連接，轉入到細菌、酵母、植物中，利用其編碼的C₂₀多不飽和脂肪酸延伸酶產生長鏈多不飽和脂肪酸的方法和應用。

背景技術

多不飽和脂肪酸碳鏈延伸酶(polyunsaturated?fatty?acid?elongase)是脂肪酸碳鏈延伸中參與C₁₈-C₂₂多不飽和脂肪酸的碳鏈延伸反應的一類酶，是合成長鏈多不飽和脂肪酸的前提，它催化供體(乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A)的兩個碳原子引入多不飽和脂肪酸碳鏈中增加其碳鏈長度，如ALA，EPA和DHA合成途徑中的C₁₈多不飽和脂肪酸碳鏈延伸酶(Δ6脂肪酸碳鏈延伸酶)，C₂₀多不飽和脂肪酸碳鏈延伸酶(Δ5脂肪酸碳鏈延伸酶)以及C₂₂多不飽和脂肪酸碳鏈延伸酶(Δ7脂肪酸碳鏈延伸酶)，它們均屬于膜結合蛋白。根據已經克隆的延伸酶序列分析，可分為兩大家族，一類是參與PUFA(polyunsaturated?fatty?acid)合成的ELO家族，一類是在植物中廣泛存在，參與種子油脂和蠟質合成的KCS/FAE家族。脂肪酸碳鏈延伸酶具有保守的結構特征：5～6個跨膜結構域、1個保守的組氨酸活性部位(HXXHH)以及在蛋白的羧基端內質網滯留信號的雙賴氨酸結構。C₂₀多不飽和脂肪酸延伸酶具有催化二十碳五烯酸(EPA)生成二十二碳五烯酸(DPA)的功能，由于目前對膜蛋白的分離純化以及功能鑒定尚存在困難，大多從編碼這些酶的基因特點進行研究。2002年，Baoxiu?Qi等人從海洋微藻等鞭金藻(Isochrysisgalbana)中克隆得到一個多不飽和脂肪酸碳鏈延伸酶基因，命名為lgASE1，它編碼的蛋白由263個氨基酸組成，分子量為30KDa。親水性分析表明，該基因編碼的蛋白具有多次跨膜區，碳末端具有內質網定位信號。將該基因克隆到釀酒酵母細胞中，其表達蛋白對C₁₈-Δ9多不飽和脂肪酸具有特異催化活性，如將ALA(C₁₈：3n-3，Δ9，12，15)和LA(C₁₈：2n-6，Δ9，12)分別沿ω-3(Δ8)途徑和ω-6(Δ8)途徑進行碳鏈延伸轉化生成EtrA(C₂₀：3n-3，Δ11，14，17)和EDA((C₂₀：2n-6，Δ11，14)。這是有關C₁₈-Δ9多不飽和脂肪酸具有特異性延伸活性的延伸酶基因進行功能鑒定的首次報道。2004年，Suzette?L等從海洋微藻巴夫藻(Pavlova?sp.)中利用表達序列標簽(expressed?sequence?tag)法克隆得到新的延伸酶基因，命名為pavELO，其基因表達產物表現了獨有的對n-6和n-3C₂₀多不飽和脂肪酸的底物特異性，但對C₁₈和C₂₂多不飽和脂肪酸沒有活性，并可在酵母中催化EPA生成DPA。序列對比分析表明該基因與哺乳動物的PUFA延伸酶的氨基酸序列同源性較高，表明該蛋白具有延伸酶家族典型的保守結構域。2006年，Masataka，Kajikawa等人從苔蘚植物沙洲草中克隆到C₂₀長鏈不飽和脂肪酸延伸酶基因MpELO2，該基因在沙洲草中編碼類似于ELO脂肪酸鏈長延伸酶基因。酵母中的異源性表達表明MpELO2基因編碼Δ5脂肪酸鏈延伸酶，這種酶特異的作用于ALA和EPA。所述延伸酶基因有些申請了專利，2003年中國專利01804692.4公開了德國專利“新延伸酶基因以及制備多不飽和脂肪酸的方法”。

由于人體不能合成多不飽和脂肪酸，只能從膳食中攝取，多不飽和脂肪酸如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)在營養強化、促進大腦發育、降血壓、防止動脈粥樣硬化等方面具有重要作用，目前深海魚類是EPA及DHA的主要商業來源。