[發(fā)明專利]蘆葦γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710014450.6
• 申請日: 2007-05-23
• 公開（公告）號: CN101067136A
• 公開（公告）日: 2007-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 向鳳寧;趙翠珠;夏光敏;于延沖;喬孟
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N15/82
• 代理公司: 濟南圣達(dá)專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 李健康

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及蘆葦富集重金屬相關(guān)基因——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著工業(yè)的發(fā)展和人類生產(chǎn)活動的加劇，重金屬污染已成為全球關(guān)注的問題。目前我國存在數(shù)千萬畝的重金屬污染土壤，對人類健康造成了極大地危害。因此，有效地去除重金屬污染成為當(dāng)前一個十分迫切的任務(wù)。

利用轉(zhuǎn)基因改良植物技術(shù)將新的性狀轉(zhuǎn)入高生物量植物中，以此開發(fā)高效的轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)系統(tǒng)，用于重金屬污染的土壤修復(fù)是一項具有廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)。

基因工程在植物重金屬的富集方面已取得了一些相關(guān)的研究進展，已識別和克隆了大量相關(guān)基因，并將這些基因轉(zhuǎn)入植物中，用于重金屬污染的土壤修復(fù)研究。許多實驗表明，將細(xì)菌、真菌、動物及植物本身與重金屬脫毒相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入高生物量植物，異源表達(dá)產(chǎn)物可介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物耐受和高積累重金屬及類似物。

目前，已證明對重金屬修復(fù)有顯著作用的主要有：植物絡(luò)合素(phytochelatins，PCs)。它是由重金屬誘導(dǎo)而合成的一類小分子多肽，能鰲合重金屬，從而減輕重金屬對植物的毒害。PCs并非基因的直接產(chǎn)物，而是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylsysteine?synthetase，γ-ECS)、谷胱甘肽合成酶(GS)和植物絡(luò)合素合酶(PCS)分三步催化而合成。目前，已克隆了多個參與PCs生物合成的基因，并在生物量小的擬南芥和印度芥菜中證實了它們富集重金屬的功能。

蘆葦(Phragmites?communis?Trirn)可超富集重金屬(Cd²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺)，為濕地處理污水的主要植物物種，然而其重金屬富集相關(guān)基因的克隆特別是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的克隆尚未見報道。

多花黑麥草、高羊茅、剪股穎為生物量大、生長快的優(yōu)良草坪草。但是，經(jīng)檢索，將蘆葦?shù)摩?谷氨酰半胱氨酸合成酶基因轉(zhuǎn)入剪股穎以提高它的抗重金屬的性能尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種蘆葦富集重金屬相關(guān)基因——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案在于從蘆葦中分離得到γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS，然后將該基因轉(zhuǎn)到高生長量的草坪草中以實現(xiàn)土壤重金屬污染的修復(fù)。

本發(fā)明提供的基因名稱為蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS，所述基因cDNA序列如序列表SEQ?ID?No.1所示。

本發(fā)明還提供了一種含上述的蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的植物表達(dá)載體pROK2，其特征在于所述載體克隆區(qū)域核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.2所示。

本發(fā)明所述基因PcGCS在培育抗重金屬植物中的應(yīng)用。

將本發(fā)明所述基因?qū)胫参锛?xì)胞，植物就可以獲得富集重金屬的能力，為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞系進行篩選，可以對本發(fā)明所述植物表達(dá)載體pROK2進行加工，如可以加入選擇標(biāo)記(GUS等)或者具有抗性的抗生素標(biāo)記物(潮霉素，卡那霉素，慶大霉素等)，任何一種可以將外源基因?qū)胫参镏斜磉_(dá)的載體都可以應(yīng)用，優(yōu)選的載體是pROK2。

本發(fā)明所述的基因可廣泛用于培育抗重金屬的生物量大、生長快的植物品種，其中所述植物優(yōu)選剪股穎。

本發(fā)明的有益效果：利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，本發(fā)明首次克隆得到了蘆葦?shù)摩?谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS并通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因轉(zhuǎn)入生物量大、生長快的植物品種特別是剪股穎中，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株的富集重金屬的能力得到了很大程度的提高。

附圖說明

圖1為蘆葦γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因的cDNA電泳圖，其中：泳道1為基因的cDNA，M為Marker。

圖2為剪股穎抗卡那霉素篩選培養(yǎng)基選擇壓力的確定圖，其中：1為0mg/L卡那霉素，2為5mg/L卡那霉素，3為10mg/L卡那霉素。

圖3為轉(zhuǎn)基因剪股穎的DNA鑒定圖，其中：泳道1、2、3、4、5均為剪股穎轉(zhuǎn)基因植株的cDNA，泳道6為Marker。

圖4為GCS標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

實施例1、PcGCS的克隆

1.1蘆葦總RNA的提取

(1)蘆葦材料放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成均勻的粉末。注意研磨過程中要保證材料浸在液氮中。