[發明專利]一種抗菌肽基因及其制備方法和該基因在畢赤酵母載體中的表達質粒的構建

無效

• 申請號: 200710012919.2
• 申請日: 2007-09-21
• 公開（公告）號: CN101392249A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發明（設計）人: 張惠文;羅永平;王小剛;蘇振成;張成剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/81;C07H21/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是一種抗菌肽基因及其制備方法和該基因在畢赤酵母載體中的表達質粒的構建。

背景技術

抗生素在過去的大半個世紀里極大地延長了人類的壽命，但同時隨著抗生素的長期使用，引發了許多抗藥性病源微生物。而近年來發展起來的抗菌肽不僅具有廣譜抗菌活性和其他一些藥用價值，更重要的是它們幾乎不會產生耐藥性問題。

抗菌肽是一類具有免疫學功能的小分子活性多肽的統稱。它們具有抗細菌、真菌、腫瘤、病毒、內毒素和原生動物，刺激單核細胞和嗜中性白細胞的趨化作用，促進創傷愈合等生物活性。主要存在于昆蟲中，現在幾乎在所有的物種中都分離到了。

微生物很容易通過基因突變對傳統的抗生素產生耐受性，然而，微生物通過基因突變的方式來產生對抗菌肽的耐受性幾乎是不可能的。因為其抗菌機制是不同的：抗生素一般是通過抑制細菌的細胞壁、蛋白質或DNA等的合成來發揮作用的，這種作用需要一些特殊受體；而抗菌肽一般是通過物理作用造成細胞膜的穿孔，這樣就不需要一些特殊的受體。

1975年瑞典科學家G.Boman等人從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導分離得到一種殺菌肽，并將其命名為cecropin。1988年Jaynes?J?M利用電腦模擬技術以天蠶素(Cecropin)B為藍本，在不改變二級結構的前提下，合成了一個與天蠶素B類似的抗菌肽——Shiva-1。結果Shiva-1中有約60％的氨基酸被置換，且C末端的酰胺化的甘氨酸也變成去酰胺化的甘氨酸。分子螺旋度Shiva-1為65％，Cecropin為53％。N端一半形成一個結構近于完美的極化的兩親性(amphipathic)α-螺旋，即圓柱形分子的縱軸一邊是帶正電荷的親水集團而對稱面是疏水區；C端一半為疏水尾。具有兩親性α-螺旋結構的蛋白質與質膜相作用，這使Shiva-1抗菌活性主要依賴于兩親性α-螺旋結構。Shiva-1對革蘭氏陽性菌、特別是對革蘭氏陰性菌有強大的殺傷力，致死濃度均在μ?mol/L級；100μmol/L就可以使瘧疾原蟲完全致死；對腫瘤細胞的殺傷作用具有選擇性，與目前常用的抗癌藥物有明顯的不同，腫瘤細胞的細胞骨架的缺陷是殺菌肽選擇性殺傷作用的位點。Shiva-1的抗菌和瘧疾原蟲活性遠強于天然的天蠶素B，而對感染和未感染的寄主細胞均沒有傷害。對癌細胞的作用優于Cecropin?B，如對癌細胞鈣離子逸出的濃度Shiva-1為50μg/ml，而Cecropin?B為150μg/ml。Shiva-1破壞腫瘤細胞的鈣離子通道使胞內的鈣離子在短時間內大量逸出，也是導致腫瘤細胞損傷不可恢復的原因之一。近年來已有人報道將38個氨基酸的Shiva-1序列N端的兩個氨基酸蛋氨酸和脯氨酸去掉，活性和表達量基本不受影響。

Shiva-1已經在大腸桿菌、泡桐、蒼蠅之中得到了表達，Cecropin?B也已經在畢赤酵母中得到了表達。酵母本生就是很好的高蛋白飼料，通過基因表達技術可實現將具有抗菌活性的肽類隨著酵母飼料的喂養直接攝入禽畜體內，增強其免疫力，簡單方便；在飼料發酵過程中同步獲得，成本降低。用酵母表達抗菌肽易于實現其藥用價值的早日市場化。

發明內容

本發明目的在于提供一種用酵母表達抗菌肽易于實現其藥用價值的抗菌肽基因及其制備方法和該基因在畢赤酵母載體中的表達質粒的構建。

為實現上述目的本發明采用的技術方案為：

抗菌肽基因：由SEQ?ID?NO.1序列表所示，其中序列由135bp組成，序列前端加Kex2蛋白酶切割位點，后面加終止密碼子TAA，兩端有EcoR?I和Xba?I酶切位點。

抗菌肽基因的制備方法：

a.用引物F1和R1互為模板，通過聚合酶鏈式反應得抗菌肽Shiva-1基因序列的中間段78bp的粗產物；

b.將上述擴增產物在質量百分比為15％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，回收抗菌肽Shiva-1基因序列的中間段78bp的目的片斷；

c.以步驟b)回收得到的產物為模板，用引物F2和R2通過聚合酶鏈式反應得到抗菌肽Shiva-1基因全序列的粗產物；

d.將步驟c)擴增產物進行質量百分比為15％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，回收抗菌肽Shiva-1基因全序列；

其中：

F1：5′TgTTCAgAAgAATCgACAgAgTTggTAAgCAAATTAAgCAAggTATCC?3′

R1：5′CgACCAAggCgATAgCTggACCggCTCTCAggATACCTTgCTTAATTTg?3′