[發(fā)明專利]惡臭假單胞菌甲醛脫氫酶基因、編碼蛋白及重組載體

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710012803.9
• 申請日: 2007-09-12
• 公開（公告）號: CN101386862A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙宗保;王金霞
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/65
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 馬 馳;周秀梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及惡臭假單胞菌甲醛脫氫酶新基因的克隆、表達及生物活性，更具體說是一種從惡臭假單胞菌基因組DNA中分離的甲醛脫氫酶新基因，利用基因工方法在大腸桿菌表達系統(tǒng)高效表達并純化出具有生物活性的重組甲醛脫氫酶。

背景技術(shù)

甲醛是最重要的化工產(chǎn)品之一，它除可直接用作消毒劑、殺菌劑及防腐劑外，還廣泛用于有機合成、合成材料、涂料、塑料、樹脂、建筑材料、表面活性劑和農(nóng)藥等行業(yè)。近來，與甲醛相關(guān)的新的健康威脅已被揭示。比如，某些經(jīng)先進手段預(yù)處理的水，生物體的代謝產(chǎn)物，以及人們經(jīng)常食用的水果、蔬菜和肉類里都含有甲醛。甲醛已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織確定為致癌和致畸形物質(zhì)，也是潛在的強致突變物和誘導(dǎo)細胞凋亡的化學介質(zhì)之一。它通過與蛋白和核苷酸發(fā)生非特異性反應(yīng)而幾乎對所有的生物體產(chǎn)生毒害。因此急需建立一種簡便、靈敏和可靠的甲醛分析方法，用于測定商品、環(huán)境和生物樣品中的甲醛含量，以及在生物體某些功能的研究中測定甲醛的產(chǎn)生。其中，酶學方法因其具有高選擇性和靈敏性，通常被認為是最好的方法。本發(fā)明所述的甲醛脫氫酶可用于生物分析過程中對甲醛含量進行測定，但是它的廣泛使用因其商品化酶低的酶活和分離自野生型酶制品高的價格受到嚴重限制。同時，在大規(guī)模手性化合物的不對稱合成中NADH的原位再生需要用到大量甲醛脫氫酶。因此需要大規(guī)模制備工程化重組甲醛脫氫酶。

甲醛脫氫酶(FDH，EC1.2.1.1)廣泛存在于酵母、細菌、動物和植物等各種生物中，這類酶屬于含鋅乙醇脫氫酶(ADH)家族。大多數(shù)甲醛脫氫酶只有在NAD⁺與谷胱甘肽(GSH)同時存在下才能氧化甲醛，稱之為GSH依賴型甲醛脫氫酶。而來自惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)的甲醛脫氫酶(PFDH，EC1.2.1.46)是一類能在不添加GSH的情況下依賴NAD⁺氧化甲醛的酶，稱之為不依賴GSH型甲醛脫氫酶。

當前商品化不依賴GSH型甲醛脫氫酶價格昂貴。申請人對購自中國普通微生物菌種保藏管理中心的惡臭假單胞菌AS?1.643基因組中的PFDH基因進行了分離、克隆和異源表達，并純化獲得了高純度、高酶活的酶制品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種惡臭假單胞菌甲醛脫氫酶基因、編碼蛋白及重組載體，該載體使所述在大腸桿菌中一部分以胞內(nèi)可溶的形式表達，其可溶蛋白表達量為13.7mg/L；上述重組載體的表達產(chǎn)物經(jīng)超聲波裂解后通過鎳親和層析，可得到純度在95％以上的重組蛋白，得率為11mg/L；上述重組載體的表達產(chǎn)物在NAD⁺存在下催化甲醛脫氫形成甲酸，最高比活可達38U/mg以上，對甲醛的表觀K_m為0.116±0.016mM。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種惡臭假單胞菌甲醛脫氫酶基因，具有序列表SEQ?ID?No:1中核苷酸序列。

所述惡臭假單胞菌甲醛脫氫酶基因編碼的蛋白質(zhì)，具有序列表SEQ?IDNo:2中氨基酸序列；是一種可在NAD⁺存在下催化甲醛脫氫形成甲酸的酶制劑；可在生物分析過程、CO₂轉(zhuǎn)化為甲醇以及生物功能研究中的應(yīng)用。

一種重組載體，其于原核表達載體pET24b(+)上克隆有序列表SEQ?IDNo:1中核苷酸序列，構(gòu)建成新的重組質(zhì)粒pET24b-PFDH，該質(zhì)粒C末端含有6個組氨酸殘基(His₆)親和標簽的高效表達載體。

其操作過程為：

(1)本發(fā)明所選擇的惡臭假單胞菌AS?1.643，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。根據(jù)NCBI中報道的不依賴GSH甲醛脫氫酶的基因末端序列，設(shè)計并合成兩條引物，以惡臭假單胞菌AS?1.643基因組DNA為模板，通過PCR得到相應(yīng)的基因產(chǎn)物(圖1)，純化后經(jīng)NdeI/XhoI酶切，克隆到表達載體pET24b(+)中(圖2)。該載體可表達C末端含有His₆標簽的蛋白質(zhì)，便于利用固定化金屬配體親和層析進行純化。

采用序列表SEQ?ID?No:1中一部分DNA片段作為引物，在上游引物中引入了NdeI酶切位點，下游引物中引入了XhoI酶切位點；用菌落PCR的方法，從惡臭假單胞菌基因組DNA中分離到甲醛脫氫酶基因(fdhA)；

(2)利用基因工程的方法，在大腸桿菌(E.coli)高效表達系統(tǒng)中表達，并純化得到重組惡臭假單胞菌甲醛脫氫酶PFDH；