[發(fā)明專利]一種擴增造血干細胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710012762.3
• 申請日: 2007-09-07
• 公開（公告）號: CN101381700A
• 公開（公告）日: 2009-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬小軍;李雙月;王為;于煒婷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 馬 馳;周秀梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種三維條件下擴增造血干細胞的方法。具體地說是制備微囊化單個核細胞，利用微膠囊及微囊化材料自身的理化性質(zhì)促進基質(zhì)細胞生成，實現(xiàn)造血干細胞與同源基質(zhì)細胞三維共培養(yǎng)，基質(zhì)細胞同時分泌細胞外基質(zhì)和細胞因子，在微膠囊內(nèi)共同構(gòu)成類造血微環(huán)境，在僅用少量細胞因子的情況下，抑制/延緩造血干細胞走向分化，并實現(xiàn)造血干細胞的有效擴增。

背景技術(shù)

造血干細胞在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景，它在血液系統(tǒng)疾病、實體瘤、免疫缺陷病、遺傳性疾病、自身免疫性疾病等的支持治療、免疫治療、替代治療及基因治療中具有廣泛的用途。但造血干細胞移植在實際應(yīng)用中存在數(shù)量限制的問題，需要有效擴增。目前，模擬體內(nèi)造血微環(huán)境已經(jīng)被認為是體外擴增造血干細胞的最佳方法之一。

造血微環(huán)境是由基質(zhì)細胞、基質(zhì)細胞分泌的細胞外基質(zhì)和細胞因子構(gòu)成的三維空間。體外模擬造血微環(huán)境的方法包括：(1)在三維支架上培養(yǎng)造血細胞；(2)與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)；(3)添加造血細胞因子。但上述途徑分別存在如下問題：(1)培養(yǎng)規(guī)模難以放大，不能滿足臨床使用要求；(2)異源性基質(zhì)細胞及建系的基質(zhì)細胞與造血干細胞共培養(yǎng)，可能存在免疫排斥問題，而同源基質(zhì)細胞的制備過程繁瑣，需要較長時間；(3)單用細胞因子不能維持體外長期造血，而且細胞因子用量大，費用昂貴，大大限制了造血干細胞的大規(guī)模擴增。因此，需要發(fā)展一種三維培養(yǎng)體系，不但能免除同源基質(zhì)細胞的制備過程，而且僅需少量細胞因子就能有效擴增造血干細胞。

基于造血干細胞的不對稱分裂原則，起始培養(yǎng)細胞中盡可能多的保留造血干細胞是體外擴增的關(guān)鍵。而造血干細胞從單個核細胞中分離、純化時不可避免的會發(fā)生部分丟失，且高度純化的造血干細胞完全丟失其他輔助細胞，不僅導致增殖能力的降低，移植物抗白血病及移植物抗宿主效應(yīng)也會發(fā)生變化。因此，為擴增出更多、更原始的造血干細胞，以單個核細胞為起始培養(yǎng)細胞是最佳的選擇。

本專利提出：以海藻酸鈉-殼聚糖(alginate-chitosan，AC)為復合材料、根據(jù)單個核細胞來源及初始單個核細胞中CD34⁺細胞數(shù)量確定制備工藝及材料選擇，制備微囊化單個核細胞，并利用微膠囊膜對生物分子的選擇性通透作用、海藻酸鈉的理化性質(zhì)和微膠囊內(nèi)的滲透壓脅迫等微環(huán)境，促進基質(zhì)細胞生成，實現(xiàn)造血干細胞與同源基質(zhì)細胞的三維共培養(yǎng)。由于微膠囊膜的截留特性，基質(zhì)細胞分泌的細胞外基質(zhì)將聚集在微膠囊內(nèi)，細胞因子在微膠囊內(nèi)也會實現(xiàn)暫態(tài)高濃度，這樣就可以少用或不用細胞因子實現(xiàn)造血干細胞的有效擴增。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、成本低廉、可規(guī)模化的造血干細胞體外擴增方法，其將在血液生物學和臨床應(yīng)用研究中發(fā)揮重要作用。該方法可以利用微膠囊的特定理化性質(zhì)模擬造血微環(huán)境，實現(xiàn)造血干細胞與多種細胞(如：基質(zhì)細胞、轉(zhuǎn)基因細胞)三維共培養(yǎng)，有效擴增造血干細胞。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種擴增造血干細胞的方法，以海藻酸鈉、殼聚糖為復合材料，采用擠出/外部凝膠化法制備AC微囊化單個核細胞；將微囊化單個核細胞加入到擴增培養(yǎng)基中，置37℃、空氣中含體積5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天定期更換培養(yǎng)基，即為造血干細胞擴增體系。

具體為：

1)單個核細胞的分離：采用密度梯度離心法，用Ficoll淋巴細胞分離液密度梯度離心分離臍血或骨髓中的單個核細胞；其中含有總細胞個數(shù)0.7-3.1％的CD34⁺細胞；

2)微囊化單個核細胞的制備：

A.將β-L-古洛糖醛酸重量含量30-40％、α-D-甘露糖醛酸重量含量為60-70％的海藻酸鈉配制成1.0-3.0％w/v海藻酸鈉溶液I；

將β-L-古洛糖醛酸重量含量60-70％、α-D-甘露糖醛酸重量含量為30-40％的海藻酸鈉配制成0.8-2.5％w/v海藻酸鈉溶液II；

將海藻酸鈉溶液I和海藻酸鈉溶液II按1∶5-5∶1體積比例混合，得海藻酸鈉溶液III；

B.將單個核細胞重懸于海藻酸鈉溶液III中，每ml溶液中含有細胞8×10⁵-2×10⁷個；

C.采用擠出/外部凝膠化法將海藻酸鈉細胞懸液加入pH＝7.0-7.4質(zhì)量濃度0.8-1.6％氯化鈣的水溶液中，獲得直徑大小在300-500μm之間的海藻酸鈣膠珠；