[發(fā)明專利]基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710011839.5
• 申請日: 2007-06-25
• 公開（公告）號: CN101333542A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何星儒
• 申請（專利權(quán)）人: 何星儒
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 楊華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過pcDNA基因載體體外轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子基因，促使眼內(nèi)移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化，同時(shí)特異性分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和大量相關(guān)生長因子，營養(yǎng)、支持周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

在細(xì)胞的分化過程中，細(xì)胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。機(jī)體在發(fā)展適應(yīng)過程中為了彌補(bǔ)這一不足，保留了一部分未分化的原始細(xì)胞，稱之為干細(xì)胞(stem?cell)。一旦生理需要，這些干細(xì)胞可按照發(fā)育途徑通過分裂而產(chǎn)生分化細(xì)胞。即干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells，MSCs)就是其中之一。在體內(nèi)、外不同’條件下，MSCs可以定向地被誘導(dǎo)分化為中胚層來源的細(xì)胞如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肌腱細(xì)胞，還可跨胚層向內(nèi)胚層和神經(jīng)外胚層的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。有研究表明MSCs能分泌某些神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophic?factor，BDNF)和神經(jīng)生長因子(neurotrophin，nervegrowth?factor，NGF)，此外MSCs分化的神經(jīng)元樣和星形膠質(zhì)樣細(xì)胞可能也分泌生長因子。星形膠質(zhì)細(xì)胞也產(chǎn)生許多生長因子，包括神經(jīng)營養(yǎng)素家族所有成員如NGF、BDNF、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CiliaryNeurotrophic?Factor，CNTF)和成纖維細(xì)胞生長因子(BasicFibroblast?Growth?Factor，bFGF)等，這些細(xì)胞因子能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)元細(xì)胞的增殖和分化。

NGF是神經(jīng)元存活、生長、分化所必需的一類分泌性蛋白質(zhì)，其中最具代表性的是BDNF。BDNF能促進(jìn)若干種離體培養(yǎng)的神經(jīng)元存活和突起生長；在體內(nèi)能阻止某些神經(jīng)元的程序性死亡。視覺系統(tǒng)中視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層(GCL)的無長突細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞都能表達(dá)BDNF的mRNA，并具有BDNF受體，但BDNF的合成主要是在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)橫斷后，眼內(nèi)注入BDNF能挽救大量的節(jié)細(xì)胞免于凋亡。

當(dāng)代基因工程提供了各種載體，可將核酸片段導(dǎo)入細(xì)胞中表達(dá)。其中脂質(zhì)體基因載體是較為廣泛和安全的一種。該載體可將外源基因整合到靶細(xì)胞中，使目的基因在靶細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明。

因此，利用pcDNA將BDNF基因?qū)隡SCs，這種重組了BDNF基因的MSCs植入眼底后，由于BDNF的作用，較未經(jīng)基因修飾的MSCs可提高眼內(nèi)存活能力及向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的比例，同時(shí)大量旁分泌的BDNF因子和相關(guān)生長因子，可以營養(yǎng)、支持周圍的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，特別是一些病變組織及周圍細(xì)胞。因此本方法可以為將來干細(xì)胞治療青光眼、視網(wǎng)膜色素變性、視神經(jīng)挫傷及老年黃斑變性、糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜眼底疾病提供來源充足、可取自自體的種子細(xì)胞，以及使種子細(xì)胞能更好地發(fā)揮補(bǔ)充受損視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，維持、保護(hù)殘存視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞作用的新方法。另外，轉(zhuǎn)導(dǎo)某些缺陷基因或治療基因，在提外對MSCs進(jìn)行功能激活和調(diào)控，將其作為基因治療的載體；利用MSCs在體內(nèi)的靶向性，還可將載有目的基因的MSCs用于治療遺傳性神經(jīng)病和神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病，同時(shí)為與之相關(guān)的藥物開發(fā)和篩選提供了一種新的模型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法。通過自制的重組人類BDNF基因的脂質(zhì)體，將BDNF基因?qū)隡SCs，經(jīng)篩選獲得重組了BDNF基因的MSCs(BDNF-MSCs)，將BDNF-MSCs植入眼底，在自分泌的BDNF誘導(dǎo)下定向分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，并特異性分泌BDNF因子和相關(guān)生長因子修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法。采用以下技術(shù)方案：一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于移植前在體外用外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。

所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于所述的外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子為人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因。

所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于通過脂質(zhì)體將外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因?qū)腴g充質(zhì)干細(xì)胞。

所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞眼內(nèi)移植修復(fù)視網(wǎng)膜損傷的方法，其特征在于重組質(zhì)粒以特定的濃度、時(shí)間感染間充質(zhì)干細(xì)胞，從而使外源基因在間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。