[發明專利]一種用月桂酰氯修飾超氧化物岐化酶的制備方法

無效

• 申請號: 200710011687.9
• 申請日: 2007-06-14
• 公開（公告）號: CN101323845A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發明（設計）人: 李東旭;李金明
• 申請（專利權）人: 鐵嶺均坤生物工程有限公司
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司
• 代理人: 任玉龍

1、一種用月桂酰氯修飾超氧化物岐化酶的制備方法，其特征在于：用月桂酰氯在堿性條件下取代超氧化物岐化酶上的氨基酸殘基，在40-45℃下充分進行酰基化反應；通過3-6級的溫度梯度處理和三級的丙酮沉淀提純處理，最終得到穩定性和純度都比較高的月桂酰氯修飾的超氧化物岐化酶。

2、按照權利要求1所述的用月桂酰氯修飾超氧化物岐化酶的制備方法，其特征在于：所述的酰基化反應包括如下步驟：

——超氧化物岐化酶按照重量體積比1∶50-500(g/ml)溶于ph8.0-9.1磷酸鉀緩沖液中，緩慢滴加月桂酰氯，超氧化物岐化酶溶液與月桂酰氯摩爾比為1∶50-4000(酶/月桂酰氯)；充分攪拌溶解后，滴加0.5mol/L的氫氧化鈉溶液，調節超氧化物岐化酶溶液的pH值為9.0，并且維持樣品溶液的pH為9.0，在30分鐘內不發生變化為止；

——將上述溶液放置于40-45℃的水浴中攪拌1-1.5個小時，使酰化反應充分進行；過濾除去沉淀，取上清液I。

3、按照權利要求1所述的用月桂酰氯修飾超氧化物岐化酶的制備方法，其特征在于：所述的提純處理方法如下：

——對上清液I進行3-6級溫度梯度處理：初級溫度為40-45℃，終級溫度為2-8℃，每兩級間溫度梯度差為5-10℃，上清液每級溫度梯度處理都是先由初級溫度迅速降至某級溫度，保持5-20分鐘后再迅速升至初級溫度，每級降溫后都低速3500-4500轉/分鐘離心10-30分鐘，除去沉淀，得到上清液II；

——對上清液II進行三級丙酮沉淀：加入1-5倍體積的0℃以下的丙酮溶液，充分攪拌，即產生白色沉淀，低速3500-4500轉/分鐘離心5-15分鐘，棄上清液，將沉淀溶于2-5倍體積的水中，充分溶解后，重復上述操作兩次，留取沉淀；

——用5-10倍體積的50mmol/L?pH＝6.2的磷酸鈉緩沖液溶解經過三級丙酮沉淀處理所得到的沉淀，即得月桂酰氯修飾的超氧化物岐化酶。

4、按照權利要求1所述的用月桂酰氯修飾超氧化物岐化酶的制備方法，其特征在于：所述的超氧化物岐化酶可以來自豬、牛、羊、雞等家禽及牲畜的血液以及腺體中純化而得，也可以來自基因工程所得。