[發明專利]一種強陰離子預柱在磷酸化肽自動化分析過程中的應用

無效

• 申請號: 200710010679.2
• 申請日: 2007-03-21
• 公開（公告）號: CN101271116A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發明（設計）人: 鄒漢法;蔣小崗;韓廣輝;葉明亮
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N30/60
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉液相色譜技術，具體的說是一種易操作、維護方便、無需增加額外硬件裝置，并可實現了納升級毛細管柱高效液相色譜與串聯質譜聯強陰離子預柱在磷酸化肽自動化分析過程中的應用。

背景技術

翻譯后蛋白質的修飾是蛋白質組中研究的熱點課題。蛋白質磷酸化是最常見，最重要的一種蛋白質翻譯后修飾方式，蛋白質磷酸化和去磷酸化幾乎調節者生命活動的整個過程，包括細胞的增殖，發育和分化，神經活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發生等，蛋白質磷酸化還是目前所知道的信號轉導的主要傳遞方式。

蛋白質磷酸化分析的傳統方法如放射性同位素標記，Edman降解以及薄層層析等方法。這些方法操作繁瑣，需要高超的實驗技巧和較多的蛋白質，而且存在潛在的放射性危險。質譜技術已經發展成為鑒定磷酸化蛋白的重要工具之一。但是質譜在鑒定磷酸化蛋白現在仍然面臨著巨大的挑戰，其具體體現在：第一，磷酸化蛋白在細胞內中屬于低豐度蛋白；第二，磷酸化肽段的負電性使其在質譜檢測中難以質子化；第三，酶解產物中存在的大量的非磷酸化肽段的質譜信號通常會淹沒磷酸化肽的離子信號。因此，復雜蛋白酶解產物中磷酸化肽段的分離，純化和富集是質譜成功鑒定磷酸化最為重要的一步。磷酸化蛋白組的研究中，通常運用兩種不同的富集策略，富集磷酸化蛋白和富集磷酸化肽段。磷酸化蛋白的富集主要是通過磷酸化蛋白質的抗體和化學方法進行修飾改變磷酸基團的化學性質，然后特異性的分離純化。磷酸肽段的富集使用最多的是固定化金屬親和色譜(Immobilized?metal?affinity?chromatography，IMAC(Fe³⁺，Ga³⁺))。近來TiO₂和ZrO₂微柱，Al(OH)₃，Fe₃O₄/TiO₂殼孔納米顆粒等也被用來特異純化和富集磷酸肽。另外一種常用的方法是化學標記，通過化學反應特異地將磷酸基團修飾成親和位點而達到純化和富集磷酸肽的目的。

然而，磷酸化蛋白質及其酶解物樣品自動化進樣、分離分析仍然是磷酸化蛋白質組研究中的巨大挑戰.目前大規模磷酸肽樣品的自動化分析主要利用大內徑但較短的毛細管柱作為預柱，采用大流速進樣，然后再進行分離分析。Licklider等人(“Automation?of?nanoscale?microcapillary?liquid?chromatography-tandem?massspectromentry?with?a?vented?column”，《Analytical?chemistry》，P3076-3083，2002年)發明了一種帶排泄口的自動化的預柱裝置，能夠快速高效的自動化進樣進行分離分析。而在之前，所有的自動化的操作都是采用閥切換的模式進行，整個裝置構建很復雜，維護不便，且樣品損失量相當大。但Licklider等人的裝置也存在預柱更換不方便和易堵塞的缺點。有鑒于此，非專利文獻2中Yi等人(“Amicrocapillary?trap?cartridge-microcapillary?high-performance?liquid?chromatographyelectrospray?ionization?emitter?device?capable?of?peptide?tandem?mass?spectrometry?atthe?attomole?level?on?an?ion?trap?mass?spectrometer?with?automated?routine?operation”，《Rapid?Communication.Mass?Spectrometry.》，P2093-2098，2003年)進一步發展了這種自動化系統，使得預柱固定相易于更換，便于維護，且進一步減小了死體積，降低了樣品的損失。但是，在這些系統中，由于預柱與分離柱都是采用的反相C18作為固定相，它們之間的死體積對分離的影響較大，所以仍然存在分離時間延遲、峰展寬和分離窗口變窄等缺陷。而且由于磷酸肽親水性強，使用C18預柱有可能引起較大的樣品損失。

發明內容

本發明的目的在于提供一種易操作、維護方便、無需增加額外硬件裝置，并可實現了納升級毛細管柱高效液相色譜與串聯質譜聯強陰離子預柱在磷酸化肽自動化分析過程中的應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種強陰離子預柱在磷酸化肽自動化分析過程中的應用。