[發明專利]用于抑制LeY糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶I和IV的RNA干涉序列及重組干涉質粒

無效

• 申請號: 200710010099.3
• 申請日: 2007-01-15
• 公開（公告）號: CN101225383A
• 公開（公告）日: 2008-07-23
• 發明（設計）人: 張振波;閆杰;劉基巍;富力;王曉琦;燕秋
• 申請（專利權）人: 燕秋
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C07H21/04;C12N15/66;C12N15/63;A61K31/7088;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 大連萬友專利事務所
• 代理人: 王發

技術領域

本發明涉及一種特異的DNA序列及根據該序列構建的重組干涉質粒。

背景技術

惡性腫瘤是一種較為難治的疾病，尚無理想的治療方法。目前，對腫瘤的治療策略主要是采取外科手術、放射治療和化學治療等綜合手段，但每一種方法仍具有局限性并可產生一定程度的毒副作用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種依據腫瘤特異糖抗原合成及腫瘤生長、浸潤、轉移等分子機制所構建的，用于抑制LeY腫瘤寡糖抗原合成的巖藻糖基轉移酶I和IV的RNA干涉序列及重組干涉質粒。本發明主要是：應用RNAi(RNAi，RNA?interference)技術以腫瘤的特異糖抗原為靶位點，抑制細胞表面Lewis?Y(LeY)腫瘤寡糖抗原的合成。LeY分子結構為Fucα1→2Galβ→4(Fucα1→3)GlcNAc)，即通過設計并合成LeY腫瘤寡糖抗原的關鍵酶巖藻糖基轉移酶I(Fucosyltransferase?I，簡稱FUT1)和巖藻糖基轉移酶IV(Fucosyltransferase?IV，簡稱FUT4)基因的干涉序列，并采用分子克隆重組技術構建重組FUT1干涉質粒(pSilencer-4.1-FUT1?SiRNA)和重組FUT4干涉質粒(pSilencer-4.1-FUT4?SiRNA)，用于抗腫瘤藥物應用。

本發明的技術方案如下：

1.設計并合成FUT1和FUT4基因的干涉序列

應用DNASTAR軟件分析了GenBank中全部的人的FUT1/FUT4基因的同源序列，FUT1/FUT4基因的編碼序列的全長分別為1098bp和1218bp，從SiRNA設計軟件獲得的用于抗腫瘤生長的重組FUT1/FUT4的干涉質粒的DNA模板序列中各選取7條作為形成干涉序列的模板DNA序列，長度均為19bp。其中，所設計的FUT1基因的干涉序列為：FUT1-1：TGGCCGGTTTGGTAATCAG；FUT1-2：AGACTTTGCCCTGCTCACA；FUT1-3：GAGGAGTACGCGGACTTGA；FUT1-4：CAGATCCGCAGAGAGTTCA；FUT1-5：CGGCATGGAGTGGTGTAAA；FUT1-6：TGGCCTTCCTGCTAGTCTG；FUT1-7：TTCGCCTTTCCTCCCCTGC。這些序列在FUT?1基因中的位置如圖1所示。所設計的FUT4基因的干涉序列為：FUT4-1：GCCTGGCAAGTAACCTCTT；FUT4-2：GTAACCTCTTCAACTGGAC；FUT4-3：CGGACGTCTTTGTGCCTTA；FUT4-4：CATGTGACCGTGGACGTGT；FUT4-5：GTTCTACCTGGCTTTCGAG；FUT4-6：CTCGTACCTGCTTTTCCTC；FUT4-7：GCGGAGGCAGCGCTGCCTG。這些序列在FUT4基因中的位置如圖2所示。

2.構建重組FUT1干涉質粒和構建重組FUT4干涉質粒

①根據SiRNA設計軟件獲得用于抗腫瘤生長的重組FUT1/FUT4的干涉質粒的DNA模板序列，它是以上述FUT1/FUT4基因的調控區和編碼區的序列進行干涉質粒的構建。

②根據pSilencer-4.1-CMV-neo(Ambion，Inc)載體結構信息設計插入載體的FUT1/FUT4干涉質粒的DNA模板序列，即以干涉載體的多克隆酶切位點(HindIII、BamHI)為基礎，設計與干涉載體有相同粘性末端的FUT1/FUT4SiRNA模板的DNA序列，分別構建7個FUT1干涉質粒：pSilencer-4.1-FUT1-1/FUT1-2/FUT1-3/FUT1-4/FUT1-5/FUT1-6/FUT1-7；7個FUT4的干涉質粒：pSilencer-4.1-FUT4-1/FUT4-2/FUT4-3/FUT4-4/FUT4-5/FUT4-6/FUT4-7。每條鏈的5`末端含有HindIII或BamH?I的酶切位點(下劃線標出)。具體序列如下：

FUT1-1(5’-3’)

GATCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTTCAAGAGACTGATTACCAAACCGGCCAGGA

AGCTTCCTGGCCGGTTTGGTAATCAGTCTCTTGAACTGATTACCAAACCGGCCAG

FUT1-2(5’-3’)