[發(fā)明專利]耐熱堿性磷酸酶(Tthxm－AP)基因及其編碼蛋白的應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710008959.X
• 申請(qǐng)日: 2007-05-09
• 公開（公告）號(hào): CN101255437A
• 公開（公告）日: 2008-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐麗美;李建波;楊豐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國(guó)家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號(hào): C12N15/55
• 分類號(hào): C12N15/55;C12N9/14;C12P21/02
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張松亭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種來自高溫菌(Thermus?thermophilus?XM)的堿性磷酸酶基因的核苷酸序列以及該基因所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的蛋白功能及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

堿性磷酸酶(alkaline?phosphatase)(EC?3.1.3.1)是一種非特異的磷酸單酯酶，能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖。它也可以催化磷酰基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，磷酸基團(tuán)從磷酸酣轉(zhuǎn)移到醇、酚或糖等磷酸受體上。在磷元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中，堿性磷酸酶起了極其重要的作用。堿性磷酸酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)，目前在微生物界和動(dòng)物界中都檢測(cè)到堿性磷酸酶的存在。堿性磷酸酶作為一種工具酶廣泛應(yīng)用于診斷學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。

目前最常用的堿性磷酸酶是小牛腸道堿性磷酸酶和大腸桿菌堿性磷酸酶，雖然具有比活力高等特點(diǎn)，但是熱穩(wěn)定性差，限制了酶在某些領(lǐng)域的應(yīng)用。而來自高溫菌的耐熱堿性磷酸酶具有良好的熱穩(wěn)定性，可以在高溫條件下操作，因此可廣泛應(yīng)用于診斷學(xué)分子生物學(xué)等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容

申請(qǐng)人從廈門海邊熱泉分離到一個(gè)菌株高溫菌Thermus?thermophilus?XM，申請(qǐng)人已將該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)：CCTCC?M207031，保藏日：2007年4月2日，保藏于中國(guó)武漢的武漢大學(xué)中國(guó)典型生物保藏中心，其最適生長(zhǎng)溫度在70-75℃之間，該菌株能產(chǎn)生耐熱的堿性磷酸酶，具有很高的應(yīng)用潛力。但是野生的高溫菌所產(chǎn)生的耐熱堿性磷酸酶量很少，而且菌株培養(yǎng)條件苛刻，不易大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)獲得，因此基因工程重組表達(dá)是大量獲取耐熱堿性磷酸酶的最佳選擇。

本發(fā)明首次提取了高溫菌Thermus?thermophilus?XM的基因組DNA，從中克隆和鑒定了耐熱堿性磷酸酶(Tthxm-AP)基因，并在大腸桿菌工程菌中得到重組表達(dá)，從而對(duì)重組酶進(jìn)行了純化以及性質(zhì)測(cè)定，為該酶的實(shí)際應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

本發(fā)明中的編碼Tthxm-AP活性多肽的核苷酸序列是如此獲得的。以Thermusthermophilus?XM基因組DNA為模板，根據(jù)合成序列SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4作為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增所得到了SEQ?ID?No.1的序列。然后通過重組表達(dá)Tthxm-AP基因，純化Tthxm-AP基因的表達(dá)產(chǎn)物，生物學(xué)方法證明Tthxm-AP基因編碼的多肽(SEQ?ID?No.2)具有耐熱堿性磷酸酶的活性。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該核苷酸編碼一種新的耐熱堿性磷酸酶，此酶被命名為Tthxm-AP。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的Tthxm-AP的方法。

本發(fā)明還提供了這種Tthxm-AP基因序列和其所編碼的多肽。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括：一種分離出的DNA分子，它包括：編碼Tthxm-AP酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ?ID?No.1中1-1506的核苷酸序列由至少70％的相似性；或者所述核苷酸序列能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ?ID?No.1中1-1506的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ?ID?No.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ?ID?No.1中1-1506位的核苷酸序列。

在本方面的另一方面，提供了一種分離的Tthxm-AP酶，它包括：具有SEQ?ID?No.2氨基酸序列的多肽、或者其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQID?No.2序列的多肽。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有Tthxm-AP酶的方法。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明中分離的多核苷酸全長(zhǎng)為1506個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ?ID?No.1，其中開放閱讀框位于1-1506位核苷酸。

在本發(fā)明中，術(shù)語“Tthxm-AP編碼序列”是指編碼具有耐熱堿性磷酸酶活性的核苷酸序列，如SEQ?ID?No.1中的1-1506位序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ?ID?No.1序列的編碼框1-1506位核苷酸中，由一個(gè)和多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQID?No.1中1-1506位核苷酸相似性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ?ID?No.2所述的序列。該術(shù)語還包括與SEQ?ID?No.1中1-1506的核苷酸序列的相似性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。