[發明專利]一種海洋氧化短桿菌堿性蛋白酶的提取方法

無效

• 申請號: 200710008894.9
• 申請日: 2007-04-26
• 公開（公告）號: CN101294151A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發明（設計）人: 謝聯輝;林白雪;吳祖建;林奇英;黃志強
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域??本發明涉及一種酶的提取方法，特別是從海洋氧化短桿菌(Brevibacterium?oxydans)發酵液中提取堿性蛋白酶的方法。

背景技術

堿性蛋白酶(Alkaline?protease)指的是在pH值堿性范圍內水解蛋白質肽鍵的酶類，它廣泛存在于自然界生物體內。堿性蛋白酶最早發現于豬胰臟中；1945年瑞士Dr.Jaag等發現了微生物堿性蛋白酶，引起了人們對微生物堿性蛋白酶的關注(Rose?A?H，1980)。堿性蛋白酶在洗滌劑、制革、絲綢、醫藥、食品、環保、基礎研究領域得到廣泛應用。

目前用于堿性蛋白酶的生產菌種主要是枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌及短小芽孢桿菌，如我國目前使用的地衣芽孢桿菌2709和地衣芽孢桿菌1213、嗜堿性短小芽孢桿菌(Alkaliphilic?Bacillus?pumillus)B45等(張樹政，1998)。堿性蛋白酶目前的研究重點在于尋找具有高產、高效、耐高溫、耐高堿的四高型蛋白酶。

海洋微生物蛋白酶的研究始于20世紀70年代，最早由Kato等報道從海洋嗜冷菌中獲得一種新型堿性蛋白酶并進行了酶的分離、純化及性質研究(Kato?N?et?al.，1974)。海洋微生物蛋白酶具有作用pH范圍寬、最適pH和反應溫度適中、隨反應溫度的降低酶活性下降緩慢等獨特性質，海洋微生物堿性蛋白酶在洗滌、制革、絲綢等工業有廣泛的應用(曾胤新等，2000；邱秀寶、李彤，1991；陳秀蘭等，2000；馮靜等，2001)。因此從海洋微生物中提取具有特異活性的堿性蛋白酶很有意義。

發明內容

本發明的目的是從海洋氧化短桿菌(Brevibacteriumoxydans)發酵液中提取堿性蛋白酶，為洗滌、制革、絲綢等工業中堿性蛋白酶的應用提供新酶源。

本發明中所用材料：DEAE-Sepharose?Fast?Flow(二乙氨乙基瓊脂糖凝膠FF)和Superdex?G200(葡聚糖凝膠G200)為Phormacia?Biotech產品；PEG20000(聚乙二醇20000)等其他試劑為國產分析純。0.01mol·L^-1PBS溶液配置方法如下：取0.2mol·L^-1?Na₂HPO₄?33.5mL、0.2mol/LNa₂HPO₄?16.5mL、NaCl?8.5g，用蒸餾水稀釋到1000mL。海洋氧化短桿菌(Brevibacterium?oxydans)的GenBank登錄號DQ417333，購自福州騰龍生物有限公司。

本發明從海洋氧化短桿菌(Brevibacterium?oxydans)中提取堿性蛋白酶，海洋氧化短桿菌(Brevibacterium?oxydans)經發酵后，發酵液4℃，8000r·min^-1離心10min取上清，再由以下步驟完成：

1、在發酵上清液中加入硫酸銨至終濃度為40％-50％，進行沉淀；

2、用0.01mol·L^-1?PBS溶液透析除鹽，4℃，12小時；

3、PEG20000濃縮至1/5體積；

4、DEAE-Sepharose?Fast?Flow離子交換層析，0.01-0.1mol·L^-1?PBS洗脫，流速0.1-0.3mL·min^-1；

5、Superdex?G-200凝膠柱層析，0.01-0.1mol·L^-1?PBS洗脫，流速0.1-0.3mL·min^-1。

本發明的一種從海洋氧化短桿菌(Brevibacterium?oxydans)發酵液中提取堿性蛋白酶的方法，具有方法簡單、回收率高且酶的活性高等優點，提純得到的酶具有良好的熱穩定性、pH耐受性。為洗滌、制革、絲綢等工業中堿性蛋白酶的應用提供新酶源。

附圖說明

附圖為堿性蛋白酶經Superdex?G-200凝膠柱層析后的電泳檢測圖。

其中，0為空白對照；1、2為蛋白Marker；3為純化后的蛋白酶。

具體實施例??為充分公開本發明的一種從海洋氧化短桿菌(Brevibacterium?oxydans)發酵液中提取堿性蛋白酶方法，現結合具體實施例加以說明。

實施例：一種從海洋氧化短桿菌(Brevibacterium?oxydans)發酵液中提取堿性蛋白酶方法，包括以下步驟：