[發明專利]小鼠間充質干細胞的分離培養方法

無效

• 申請號: 200710007898.5
• 申請日: 2007-01-22
• 公開（公告）號: CN101353640A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 李勇;張成;熊符;于美娟
• 申請（專利權）人: 李勇;張成;熊符
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及間充質干細胞的分離培養方法。尤其是涉及小鼠的間充質 干細胞培養方法。

背景技術

間充質干細胞除具有長期自我更新和多向分化的潛能，還有免疫原性 低，被認為是細胞治療和基因治療的合適的細胞源。由于小鼠維持費 用低及它的基因分析很清楚，故當前用于細胞治療和基因治療的動物 模型一般是小鼠。

因間充質干細胞的貼壁的特性，在人、狒狒、兔、大鼠等其它動物的 骨髓中都能成功分離出間充質干細胞，而小鼠間充質干細胞在分離培 養中因非間充質細胞的污染使其遠比人和其它物種難以分離，代傳困 難。在國內，暫無人系統詳實的陳述小鼠間充質干細胞的分離方法。 最近幾年，雖有幾篇文獻介紹小鼠間充質干細胞的培養方法，但國內 的研究機構并未成功的分離培養出來。

發明內容及具體實施方案

材料和推薦試劑：

·DMEM-LG????????????????????????????·有蓋培養皿或小瓶子

·HEPES??????????????????????????????·6-孔培養板

·FBS????????????????????????????????·15ml離心管

·外科材料(適當大小的剪子，鑷子等)???·血細胞計數器

·帶有22G針頭的5ml注射器?????????????·0.3％臺盼藍(溶于PBS)

培養基

基礎培養基是DMEM-LG含3.7g/l的碳酸氫鈉各種0-15mM?HEPES。完全 培養基含10％FBS的基礎培養基。

原代培養

步驟：

1.用頸椎脫臼法殺死小鼠

2.放入70％的酒精中3分鐘左右，再轉到操凈臺上

3.移去附著在股骨、脛骨上的連接組織(用無菌的剪刀和鑷子)

4.用含有完全培養基的注射器將針頭插入骨的一端并將另一頭的骨 端剪去，也可將兩端剪去，沖洗骨髓到皿中

5.來回沖洗最多五次后，將骨棄去

6.轉移細胞懸液到15ml的離心管中，離心300-400g，10分鐘

7.在6ml的完全培養基中重懸細胞。

8.取少量與臺盼藍1∶1混合，用計數板計算細胞數

9.再離心收集細胞，以適當的完全培養基重懸細胞，使細胞的濃度 為5×10⁶/ml

10.每孔加入3.5ml的細胞懸液并放入37℃，5％CO2的孵箱

11.種板72小時后，吸出全部舊培養液，加入3.5ml的新鮮培養液

12.在上述條件下，當細胞在第1周至第2周內有70-80％的匯合時，就 可進行傳代。

MSC的傳代培養

材料和推薦試劑：

·含10mM?HEPES(鈉鹽)且無Ca2+和Mg2+的PBS液

·胰蛋白酶-EDTA液(0.25％胰蛋白酶和0.01％EDTA).

1.為取得最好的效果，在37℃下，預熱PBS

2.移去培養液，至少用1ml的PBS洗單(細胞)層兩次

3.加50μl/cm²胰蛋白酶-EDTA，37℃孵育5-10分鐘(第一到 三傳代)。從第四代起，消化時間約2分鐘

4.用兩倍體積的完全培養液再懸浮細胞，分裝到兩個新的培養瓶中 (1:2傳代)

5.當細胞匯合時，重復步驟1-4。到達匯合時，首次傳代可能需 要半個月

MSCs培養和傳代的建議

·每3或4天更換培養液

·要避免因過多的基質造成細胞無效的分離，避免細胞匯合過度

·注意消化時間的掌握，不需要一定要將所有的細胞都消化下來

·這個實驗步驟至少可應用于C57BL和mdx小鼠

附圖說明：

1.圖1第九代小鼠間充質干細胞的流式細胞結果；

2.圖2小鼠間充質干細胞光鏡圖片(40×)；

3.圖3小鼠間充質干細胞成骨圖片(100×)；

4.圖4小鼠間充質干細胞成脂圖片(100×)。

第九代小鼠間充質干細胞的流式細胞結果(圖1)、普通光鏡(圖2)及成 骨(圖3)及成脂(圖4)。