[發(fā)明專利]一種載脂蛋白－J的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710007353.4
• 申請日: 2007-01-22
• 公開（公告）號: CN101082045A
• 公開（公告）日: 2007-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 耿永健
• 申請（專利權(quán)）人: 耿永健
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/12;C07K14/435;C12N1/21;C07K1/14;C12N15/85
• 代理公司: 上海浦一知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 丁紀(jì)鐵

[技術(shù)領(lǐng)域]

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，有關(guān)采用基因重組的制備方法，具體地說是一種載脂蛋白-J的制備方法。

[技術(shù)背景]

載脂蛋白-J(apolipoprotein-J)是一種硫基化的糖蛋白異二聚體，含有兩條40KD的鏈，通過一種獨(dú)特的5個二硫鍵相連，其多肽序列如圖1所示。編碼載脂蛋白-J的mRNA，從小鼠第14號染色體的單拷貝基因轉(zhuǎn)錄而來。有幾個功能區(qū)域組成，如兩親螺旋，肝磷脂結(jié)合功能區(qū)，脂肪結(jié)合功能區(qū)等。這個蛋白最早是從公羊的睪丸網(wǎng)液體中分離，因?yàn)槟軌虼龠M(jìn)Sertoli細(xì)胞的凝集，支持精子的成熟和發(fā)展，所以命名為凝集因子(NCBI/Genbank，_NM.Sub.-203339，001831)。此后，不同物種的這一蛋白質(zhì)被不同的研究機(jī)構(gòu)分離和克隆。產(chǎn)生了很多的名字包括睪酮抑制前列腺信使2(TRPM-2)，硫化糖蛋白2(SGP-2)，載脂蛋白-J，SP-40，補(bǔ)體細(xì)胞溶解抑制劑(CTI)，二聚酸性糖蛋白(DAG)，gp80，NA1/NA2，糖蛋白III等等。很多的細(xì)胞和組織可以持續(xù)的表達(dá)低水平載脂蛋白-J。因此載脂蛋白-J存在于幾乎所有的體液中，尤其是在組織間隙或上皮細(xì)胞的表面。在血液中載脂蛋白-J是高密度脂蛋白的一個蛋白成份，與載脂蛋白AI和對氧磷酶(paraoxonase，PON1，NM-000446)的功能相關(guān)。后者是一種重要的抗氧化的酶。載脂蛋白-J是一種高度誘導(dǎo)型蛋白，多種應(yīng)激刺激因子或疾病可誘導(dǎo)載脂蛋白-J表達(dá)。例如在動脈硬化病人的病灶中的濃度很高。通常載脂蛋白-J含有一個長度為21個氨基酸的疏水或親脂多肽基因。據(jù)報(bào)道，載脂蛋白-J的功能可能包括調(diào)控細(xì)胞凋亡，補(bǔ)體防御，脂肪再生，膜保護(hù)，維持細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與基層組織之間的接觸?？梢杂行У嘏c脂質(zhì)包括膽固醇、氧化固醇結(jié)合，促進(jìn)膽固醇和氧化固醇從泡沫樣細(xì)胞流出。這個蛋白還可以抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，促進(jìn)細(xì)胞凝聚和黏附。最近，還發(fā)現(xiàn)載脂蛋白-J還是一種抗凋亡蛋白。據(jù)報(bào)道，在由于熱休克和氧化疲勞引起的細(xì)胞中能誘導(dǎo)載脂蛋白-J的表達(dá)，抵抗細(xì)胞凋亡。在凋亡的組織中出現(xiàn)高水平的載脂蛋白-J。但是，經(jīng)過對產(chǎn)生載脂蛋白-J的細(xì)胞的仔細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白-J的表達(dá)僅限于死細(xì)胞附近的活細(xì)胞，提示這個蛋白可能起到生存因子的作用，保護(hù)鄰近的細(xì)胞。近來的一些研究也顯示載脂蛋白-J是一種抗凋亡蛋白。然而，我們在利用載脂蛋白-J的生物活性功能時，必須尋找更好的方法提高它表達(dá)的合成存活率。

載脂蛋白-J指的是最早從公羊睪丸中分離的載脂蛋白J(NM-203339，NM-001831)，從其他哺乳動物中也分離到的該蛋白，有不同的命名。來自于不同動物的載脂蛋白-J的序列有不同的NCBI號碼(NM013492，NM-053021，NM-012679)。產(chǎn)生的載脂蛋白-J可以誘導(dǎo)或引起編碼乙醛脫氫酶、載脂蛋白-AI或?qū)ρ趿酌傅幕虻谋磉_(dá)，這些是具有解毒能力的蛋白或酶。天然的或重組的全長或載脂蛋白-J片段在一種或多種細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，尤其是心肌細(xì)胞或血管細(xì)胞。由于載脂蛋白-J誘導(dǎo)產(chǎn)生的乙醛脫氫酶具有解毒的作用，可以清除氧化脂蛋白和氧化固醇引起的毒性，從而具有抗動脈硬化的作用。乙醛脫氫酶是由一些哺乳動物細(xì)胞如心肌細(xì)胞、血管細(xì)胞、未分化的干細(xì)胞中的核酸編碼的。乙醛脫氫酶是一種異構(gòu)體，重組的載脂蛋白-J表達(dá)發(fā)生在一種或多種哺乳動物組織中，(即心臟、血管、肝臟、腎臟、腦)，在一定程度上可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化疲勞、缺血的損傷。

[發(fā)明內(nèi)容]

本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)生或合成全長或部分載脂蛋白-J的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的發(fā)明一種載脂蛋白-J的制備方法，其特征在于以下工藝步驟：

a、采用脫氧核糖核酸DNA重組技術(shù)制備重組人或哺乳動物的載脂蛋白-J全長或部分片段并用親和層析法純化；

b、采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚脫氧核糖核酸合成酶鏈反應(yīng)RT-PCR技術(shù)從RNA克隆并擴(kuò)增出載脂蛋白-J的全長或部分片段的互補(bǔ)脫氧核糖核酸cDNA；

c、利用DNA重組技術(shù)將載脂蛋白-J?cDNA全長或部分片段插入到一個質(zhì)粒構(gòu)成原核(如pET系列)或真核細(xì)胞(如pKS系列)表達(dá)載體，載脂蛋白-J?cDNA連接或不連接于一個標(biāo)簽多肽基因；

d、將此載脂蛋白-J表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌，在抗菌素選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)此轉(zhuǎn)染的細(xì)菌以擴(kuò)增載脂蛋白-J表達(dá)質(zhì)粒，根據(jù)質(zhì)粒所含抗菌素阻抗基因，抗菌素可選為氨芐青霉素或/和氯霉素，在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)重組載脂蛋白-J的合成；

e、收集轉(zhuǎn)染的菌體，離心沉淀，裂解釋放載脂蛋白-J，用制備層析方法分離載脂蛋白-J；