[發(fā)明專利]豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710003047.3
• 申請日: 2007-02-01
• 公開（公告）號: CN101117627A
• 公開（公告）日: 2008-02-06
• 發(fā)明（設計）人: 馮力;陳建飛;時洪艷;佟有恩;孫東波
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/33;A61K39/12;A61K35/76;A61P1/12;G01N33/569
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權代理有限責任公司
• 代理人: 孫皓晨

技術領域

本發(fā)明涉及弱毒疫苗株，尤其涉及豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株及其應用，屬于生物醫(yī)藥領域。

背景技術

豬流行性腹瀉(Porcine?Epidemic?Diarrhea，PED)是一種急性、高度接觸性的傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和新生仔豬的高死亡率為特征。

本病70年代初首先發(fā)現(xiàn)于英國和比利時。1976年，暴發(fā)了類似TGE的急性腹瀉，已排除了TGEV作為病原的可能，也不是其它已知腸致病性病原，Wood把這次暴發(fā)的腹瀉稱為腹瀉II型，以便與70年代初發(fā)生的腹瀉(稱為I型)區(qū)別。1978年Pensaert等發(fā)現(xiàn)一種類冠狀病毒的病原與II型腹瀉暴發(fā)有關。實驗表明I型和II型腹瀉的發(fā)生是由相同的冠狀病毒引起的，即豬流行性腹瀉病毒(Porcine?EpidemicDiarrhea?Virus，PEDV)故把這種腹瀉稱為豬流行性腹瀉。

1973年先后在我國上海、遼寧、吉林、黑龍江、四川等地分離到TGE和PED病毒抗原。

TGE和PED在病毒抗原形態(tài)，臨床癥狀，流行病學極其相似，唯免疫學和血清學相互沒有交叉反應。PED是獨立的豬的急性腸道傳染病。

病豬是主要的傳染源，流行主要發(fā)生在冬季，也有發(fā)生于夏季或春秋季節(jié)。病毒存在于腸絨毛上皮和腸系膜淋巴結，PEDV隨糞便排出后，污染周圍環(huán)境、車輛、衣服、鞋、用具等而散播傳染。PEDV主要通過被感染豬只排出的糞便或污染物經(jīng)口途徑自然感染。哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發(fā)病率可達100％，尤以哺乳仔豬受害最為嚴重，母豬發(fā)病率為15-90％。PED單一發(fā)生或PED和TGE混合感染發(fā)病。

病豬表現(xiàn)嘔吐，迅速腹瀉脫水，腹瀉糞便呈水樣，黃色或灰黃色，體溫基本正常，仔豬頻死前體溫下降。嘔吐多是發(fā)生在吃食和吃奶之后。中豬、肥豬和成豬常成精神委頓、厭食和持續(xù)3-7天的腹瀉，恢復后容易造成生長發(fā)育不良。病變主要在小腸，小腸充血，腸壁變薄發(fā)亮，內(nèi)充滿黃色的液體。腸系膜充血，腸淋巴結充血、水腫。實驗室診斷可采取豬小腸粘膜作抹片，進行熒光抗體染色，發(fā)病豬小腸各段可發(fā)現(xiàn)多量的熒光細胞。小腸病變開始與空腸，而后波及整個小腸段。臨床出現(xiàn)腹瀉后6小時達到高峰，主要是上皮細胞變性、壞死和脫落。感染的上皮細胞、電鏡觀察可見絨毛減少或縮短，細胞漿破裂，在胞槳的空泡內(nèi)或滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可見到病毒粒子。

免疫接種是防治該病的最有效手段。由哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的豬流行腹瀉組織滅活疫苗及豬胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗和二聯(lián)活疫苗(已商品化)，具有較好的免疫預防效果，但其預防效果還有待加強。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種新的豬流行性腹瀉病毒(Porcine?diarrhea?virus，PEDV)弱毒疫苗株，用該弱毒疫苗株所制備的疫苗對于豬流行性腹瀉病毒具有良好的保護效力。

本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現(xiàn)的：豬流行性腹瀉病毒(Porcine?diarrhea?virus，PEDV)弱毒疫苗株，其保藏號是：CCTCC-V200608；分類命名：豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗株CV777；保藏時間是：2006年12月13日；保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址：湖北省武漢市武漢大學。

本發(fā)明PEDV弱毒株的培育：用PEDV?CV777株(由比利時的Peresent教授饋贈)強毒適應Vero細胞系，傳代毒83代轉(zhuǎn)向仔豬腎(PK)原代細胞培養(yǎng)，從90代起進行5次克隆純化，頭2次選群斑，后3次選單斑，其中83-7-斑5株繼續(xù)傳代為147代，以克降后35代毒(總代次134代)進行6代次返祖試驗，對不吃初乳的仔豬均無致病性，證明傳代弱毒毒力是穩(wěn)定的。

本發(fā)明弱毒株的形態(tài)學觀察：病毒細胞培養(yǎng)物上清離心后，將收獲的病毒懸液5000rpm離心30min，取上清，然后上清液15000rpm超速離心，4℃離心2h，沉淀用適量pH7.0?PBS溶液懸浮，磷鎢酸負染電鏡檢查。結果可見到典型的冠狀病毒粒子的照片，病毒粒子呈球形，大小100～180nm，具有纖突。

通過對本發(fā)明毒株的基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)了本疫苗毒株的特有基因序列特征，其特有基因序列特征如下：ORF3基因序列總長度為626bp(SEQ?ID?NO：2)。

與?PEDV?CV777株ORF3的序列相比，本發(fā)明弱毒株與?CV777株ORF3的序列同源性為97.9％，本發(fā)明弱毒株從ORF3序列的ATG開始的第245位到293位一共缺失了49個核苷酸，具體缺失的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：3所示。