[發明專利]一種生產有效生物反應器的方法

有效

• 申請號: 200710002830.8
• 申請日: 2007-02-01
• 公開（公告）號: CN101469319A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發明（設計）人: 惠覓宙;李會成;冷國慶
• 申請（專利權）人: 杭州安普生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所
• 代理人: 王 為

發明領域

本發明涉及一種生產有效生物反應器的方法，該方法包括在本發明描述的生物反應器中培養動物細胞，通過反應器的器壁和細胞之間的摩擦增加動物細胞懸浮培養液中溶氧的方法。?

發明背景?

動物細胞的高密度懸浮培養是蛋白類藥物或疫苗產品開發的有用工具。常常需要小體積的細胞培養罐用于動物實驗研究的樣品生產，較大體積的細胞培養罐用于臨床研究藥品的生產。許多細胞生物學家喜歡應用簡化的小型懸浮培養裝置，但放大專家則喜歡“易于優化”的大體積細胞反應器系統。?

目前的生物反應器培養罐和搖瓶的形狀都是很典型的柱體形。這樣的罐體或瓶工作體積的高∶徑比大于1∶1。罐體中的培養基表面積不足于氧氣被有效吸收。常用空氣或氧氣噴射來解決這一問題。然而，過量的空氣噴射常產生泡沫和使氣泡破裂，同樣過量的氧氣噴射也毒害細胞。因此，用較復雜的控制塔和相關的溶氧探頭來監控空氣或純氧的噴射。不過，優化控制塔或探頭比較昂貴。因此，需要開發無控制塔和無相關溶氧探頭的小體積培養罐，特別是一次性罐體，和“易于優化”的大體積培養罐。?

本專利的這種設計允許不使用復雜的控制塔和相關的探頭來大體積培養細胞，也開發了一次性或可滅菌的小體積搖瓶型的懸浮培養系統。還研究了一個“易于優化”的攪拌器驅動的大體積工業化倒置的平錐底生物反應器系統。?

本發明描述了一種生物反應器，即一種懸浮細胞培養罐，該培養罐是一種寬體平錐底可在搖床上用于懸浮培養動物細胞的細胞反應器，與傳統的生物反應器和平底搖瓶相比。該培養罐可以使細胞液很容易地波及罐壁，產生很小的機械張力，形成了較寬的薄培養液層，有利于擴大表面積，增大氣體交換量，改善混合效果。?

本發明進一步的利用該培養罐對培養液進行培養，發現了一種在培養液中增加溶解氧的方法。?

發明內容

本發明提供一種利用細胞培養罐對培養液進行培養的方法，特別是在本發明描述的培養罐中對培養液增加溶解氧的方法。?

對于細胞培養，本發明發現只要培養基表面積與培養基體積比高于0.14cm2/cm3，不利用復雜的控制塔和相關的溶氧和pH探頭，也可以使懸浮的動物細胞生長良好，這種培養是在寬體平錐底培養罐(圖1)中，通過底部的空氣噴射或表面的純氧供給，在37℃用帶有20-25mM?HEPS的無血清培養基進行培養的，與傳統的柱體攪拌罐相比寬體平錐底搖瓶具有表面通氣好的優勢。?

本發明是首次利用搖瓶培養罐來培養動物細胞，驚奇的是，它們工作的效果比傳統的Applikon平底反應器好，在細胞密度、重組蛋白產量、細胞活力和細胞皮實性方面優勢明顯，顯然結合了搖床、平錐底、寬體和pH穩定的培養基，工作起來對動物細胞培養和重組蛋白的產量具有優勢。?

本發明的寬體平錐底培養罐的特點是有效的錐體角度，用塑料的不同錐角的錐底離心管研究了錐角對固定轉角搖動、培養基混合、接種體積的影響，發現如果錐角太小(比如小于30度，或者太寬，大于70度)，搖床不能使培養基很容易地波及管壁。?

本發明的寬體平錐底培養罐特點是3升懸浮培養罐不用復雜的控制塔和相關的溶氧、pH探頭，通氣是通過位于錐底最低點的空氣噴射來進行，可延長氣泡的行程，或者在培養基表面通純氧。?

應用此種寬體平錐底培養罐研究了表達的TNFR1Fc-IL-lra，IL-18bp-Fc-IL-lra，VEGFR1-Fc-IL-lra，and?Tie2-Fc-IL-lra的CHO細胞的培養，令人吃驚的是，寬體平錐底培養罐工作明顯地好于平底的Applikon攪拌型反應器和平底的搖瓶，顯然搖床搖動能夠推動培養基波及罐體壁，且不產生剪切力和機械張力，形成較大范圍的薄培養基層流，有利于擴大通氣量，?

本發明是在上述寬體平錐底培養罐基礎上，采用了溶氧探頭、pH探頭和相應的探測系統(www.flurometrix.com)(圖2a，b).同時也利用數碼相機拍照并研究寬體平錐底培養罐中培養基的運動規律。?

首先，測定了寬體平錐底培養罐中工作體積為150ml培養液的溶氧值(圖3)。發現溶氧水平很容易達到100％(表1)。然后用空氣泵在相同的罐中靜態向培養液中?泵入空氣，驚奇的是，在一定的時間內不能達到100％的溶氧(表2)，對這種現象非常驚奇，因為日常用的3升Applikon的反應器都是用泵入空氣法來較正溶氧探頭并設定溶氧為100％的，在這種現象的背后必然存在著一種作用機制。?