[發明專利]丙型肝炎病毒第一高變區抗原及其在制備丙型肝炎病毒檢測試劑中的用途

有效

• 申請號: 200710002626.6
• 申請日: 2007-01-25
• 公開（公告）號: CN101230097A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發明（設計）人: 修冰水;王國華;張賀秋;宋曉國;凌世淦;閻瑾琦;李昭
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C07K14/005
• 分類號: C07K14/005;G01N33/576;G01N33/569
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技術領域

本發明涉及肝炎病毒的抗原，具體涉及丙型肝炎病毒高變區抗原，還涉及該抗原在制備檢測丙型肝炎病毒試劑中的用途。

背景技術

HCV感染引起的丙型肝炎是一種十分嚴重的傳染性肝臟疾病。目前，我國共有患者4000萬，并且隨著賣淫、吸毒、不規范輸血等社會問題的出現呈增加趨勢。由于丙型肝炎多為慢性病毒感染性疾病，治療難度大，又沒有疫苗，故我國主要通過加強血制品的篩查來達到控制該病蔓延的目的，這使HCV診斷試劑的研究具有十分重要的意義。

盡管近幾年HCV的診斷領域獲得長足的發展，但是，目前的診斷技術只是停留在HCV病毒感染的確診上，并不具有真正的臨床指導意義。而在丙型肝炎的臨床藥物中，最經常使用的干擾素的總有效性僅有25％，大部分患者對干擾素不敏感(Fried?MW?and?Hoofnagle?JH.Therapy?of?hepatitis?C，SeminLiver?Dis，1995；15：82-91)。由于IFN治療的療程長、費用高、副作用大，因此，迫切需要發展一種可用于預測IFN療效的診斷試劑。

在HCV變異的研究中，位于病毒第二包膜蛋白N端的第一高變區(HVR1)處于十分重要的地位。研究顯示：盡管HVR1僅有27個氨基酸，但其變異占到整個病毒基因組變異的80％以上，常以HVR1序列的變化作為衡量病毒變異的標準；HVR1含有HCV唯一的中和性抗原表位，其抗體能阻止病毒吸附敏感細胞，早期HVR1抗體的出現，有助于疾病的自愈；HVR1的變異的復雜程度與IFN的治療效果有密切關系等(修冰水，凌世淦。丙型肝炎病毒第一高變區的研究進展，國外醫學病毒學分冊，2000，7(5)：158-160)。國內外十分重視對HCV病毒變異的檢測，現在，對HCV變異的檢測是建立在“HCV-RNA的提取-逆轉錄-PCR”三大環節的基礎上。根據最后PCR產物分析的手段不同分為以下幾種：

1.序列分析法

這是其他所有檢測變異技術的基礎。最后通過對PCR產物的直接克隆測序，來對HCV病毒的變異情況進行檢測。由于HCV變異大，有時甚至同一標本的不同克隆序列亦有差異。因此該方法測序工作量大、重復性差、周期長，難以進行大數量的研究。

2.PCR-限制性長度多態性法(RFLP)

用同一種限制性內切酶對PCR擴增的DNA片段進行酶切，根據酶切圖譜進行多態性分析，檢測病毒的變異。該方法比序列分析法簡單快速，能進行大批量樣本的處理。但該方法要求被檢測位點附近的堿基高度保守，多用于HCV的基因分型。

3.PCR-單鏈構象多態性分析法(SSCP)

該方法目前應用較廣的HCV變異檢測技術。PCR擴增靶序列后，變性成單鏈后進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，由于變異單鏈的構象不同導致電泳的遷移率不同，最終形成不同的帶型，從而確定病毒的變異與否。SSCP簡單、易行，但無法確立變異的部位，同時，只有少于200bp以下的PCR產物才能達到檢測病毒變異的敏感性。鑒于此，SSCP通常采用HVR1作為檢測的靶序列(劉錫光，祁自柏，熊詩松，肝炎實驗診斷指南，人民衛生出版社，第一版，2004，175-179)。

不難看出，上述幾種方法無法離開對HCV病毒RNA的檢測，對人員素質、設備要求高，因此，至今國內外對HCV變異的檢測僅限于大的科研機構水平，無法進行大規模推廣。尋找一種簡單、快速、重復性好、易于推廣的HCV變異的檢測方法，無疑是HCV基礎、臨床研究中亟需解決的問題。

發明內容

為了使HCV變異的檢測滿足臨床的需要，本發明通過對HCV診斷領域的深入研究，提出了一種用于檢測HCV變異的新方法。本發明以HVR1作為研究靶點，通過生物信息學篩選多種HVR1抗原，采用間接酶聯免疫法，檢測HCV患者血清中HVR1抗體的異質程度，從而建HCV變異的多靶點檢測技術。

本發明的目的是提供丙型肝炎病毒第一高變區抗原及抗原組合。

本發明公開的丙型肝炎病毒第一高變區抗原，其氨基酸序列分別如序列表中下列序列所示：

(1)序列表中序列2，

(2)序列表中序列4，

(3)序列表中序列6，

(4)序列表中序列9，

(5)序列表中序列11，

(6)序列表中序列12，

(7)序列表中序列14，

(8)序列表中序列15，

(9)序列表中序列16，

(10)序列表中序列18，

(11)序列表中序列19，

(12)序列表中序列21，