[發(fā)明專利]新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和生產(chǎn)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680053881.7
• 申請日: 2006-08-10
• 公開（公告）號: CN101400789A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發(fā)明（設計）人: 塚本浩史;峰利喜;高倉由光;山本岳
• 申請（專利權(quán)）人: 日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N1/21;C12N1/20;C12N9/10;C07H21/04
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 張平元

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、編碼該酶的基因、生產(chǎn) 該酶的微生物和該酶的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

糖轉(zhuǎn)移酶是與生物體內(nèi)的糖蛋白、糖脂等(以下稱復合糖)的糖鏈的 生物合成相關的酶。其反應生成物即復合糖的糖鏈在生物體內(nèi)具有非常重 要的功能。例如，已知糖鏈是一種重要的分子，其主要在哺乳動物細胞中 作為處于分化、發(fā)育的細胞間及細胞-細胞外基質(zhì)信號傳導、復合糖的靶標 而發(fā)揮作用。

其應用例為血液中生產(chǎn)紅血球的激素促紅細胞生成素。天然的促紅細 胞生成素存在效果持續(xù)性差的缺點。因此，促紅細胞生成素是一種糖蛋白， 通過附加新的糖鏈開發(fā)了可延長生物體壽命的重組促紅細胞生成素蛋白， 并生產(chǎn)且實現(xiàn)了商品化。今后，此類附加或改變糖鏈的醫(yī)藥品、功能性食 品等的開發(fā)也會越來越多。因此，尋求開發(fā)一種可任意合成/生產(chǎn)糖鏈的方 法。其中，一種最有效的方法是糖轉(zhuǎn)移酶的開發(fā)，其重要性越來越明顯。

至今為止，已經(jīng)從人、小鼠、大鼠和酵母等真核生物中分離出約150 種以上的糖轉(zhuǎn)移酶基因。并已進一步在CHO細胞、大腸桿菌等宿主細胞中 發(fā)現(xiàn)了該基因，且生產(chǎn)出具有糖轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。另一方面，從原核 生物細菌中也分離出20～30種糖轉(zhuǎn)移酶基因，并已進一步在使用大腸桿菌 的重組生產(chǎn)系統(tǒng)中表達具有糖轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)，還闡明了其底物特性、 各種酶化學性質(zhì)。

由于唾液酸多存在于糖鏈的非還原末端，對于糖鏈功能的表達，是極 為重要的糖。于是，在糖轉(zhuǎn)移酶中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶是最重要且高活性酶的 一種。關于β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其基因，有很多動物，特別是 哺乳類動物來源的報道(Hamamoto，T.等，Bioorg.Med.Chem.，1， 141-145(1993)；Weinstein，J.等.，J.Biol.Chem.，262，17735-17743(1987))。但 由于這些動物來源的酶很難純化，不能大量獲得，價格很高，而且存在酶 穩(wěn)定性差的問題。另一方面，有唯一一篇報導稱已從屬于美人魚發(fā)光桿菌 (Photobacterium?damselae)的微生物中獲得了微生物來源的β-半乳糖苷 -α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其基因(國際公開第WO98/38315號；美國專利 6255094號公報)。

但由美人魚發(fā)光桿菌生產(chǎn)發(fā)光桿菌屬來源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸轉(zhuǎn) 移酶的生產(chǎn)性為550U/L(Yamamoto，T.，等.，Biosci.Biotechnol.Biochem.， 62(2)，210-214(1998))，利用含有該基因的質(zhì)粒pEBST△178通過重組大腸 桿菌生產(chǎn)β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)性為224.5U/L(Yamamoto， T.，等.，J.Biochem.，123，94-100(1998))，目前需要一種具有更高生產(chǎn)性的 酶。此外，美人魚發(fā)光桿菌來源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的比活性 為5.5U/mg(Yamamoto，T.等.，J.Biochem.，120，104-110(1996))，從這 個角度考慮更需要尋找一種活性更高的酶。

另外，酶的種類很多，在公知的微生物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶中，生產(chǎn) 性和活性較高的例子為出血敗血性巴氏桿菌(Pasteurella?multocida)來源的 α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，其生產(chǎn)性為6,000U/L(Yu，H.，等.，J.Am.Chem.Soc.， 127，17618-17619(2005))，比活性為60U/mg。

出于對唾液酸轉(zhuǎn)移酶的高需求，更需要一種高生產(chǎn)性和/或活性高的β- 半乳糖苷-α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。

專利文獻1：國際公開第WO98/38315號小冊子

專利文獻2：美國專利6255094號公報

非專利文獻1：Hamamoto，T.等，Bioorg.Med.Chem.，1，141-145(1993)

非專利文獻2：Weinstein，J.等.，J.Biol.Chem.，262，17735-17743(1987)

非專利文獻3：Yamamoto，T.等.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(2)， 210-214(1998)