[發明專利]用于鑒定病原體的寡核苷酸微陣列

無效

• 申請號: 200680053490.5
• 申請日: 2006-12-29
• 公開（公告）號: CN101400801A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發明（設計）人: Y·古;L·徐
• 申請（專利權）人: 霍尼韋爾國際公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/70
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 劉 冬;劉 玥

本申請要求于2005年12月30日提交的美國臨時專利申請 60/755,504的權益。

發明背景

本發明涉及用于檢測檢驗樣品中病原體存在情況的檢驗試劑盒 和方法。檢驗樣品可以獲自患者或者來自可能含有病原體的食物或飲 料的來源。

諸如腦炎、腦膜炎、腦(脊)膜炎、肺炎、腸胃炎、心內膜炎、尿 道感染的疾病由病原體感染引起。病原體包括不同的細菌、病毒、真 菌和原生動物。不同的致病性感染往往具有類似的癥狀，這致使難以 提供感染或疾病的起因的確診。例如，腦炎和腦(脊)膜炎患者一般都 會出現發燒、頭痛和驚厥?？焖俣鴾蚀_地鑒定引起這些癥狀的病原體 對于確定開出什么藥方至關重要。當前用于鑒定病原體的診斷方法包 括：鏡檢、微生物培養、血清免疫測試和聚合酶鏈式反應(PCR)。這 些方法需要經過嚴格訓練的人員而且非常費時。

按照常規的PCR方法，將含有起模板作用的基因的檢驗樣品與設 計成用于擴增具有特定長度的至少一種基因的至少一對PCR引物混 合。通過使所擴增的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳并使其染色，就可 使PCR產物顯現。按照PCR方法，根據所顯現的PCR產物長度來鑒 定檢驗樣品中所含的基因。在同一樣品中可以擴增多對引物以便更有 效地篩選多種基因。

然而，隨著引物試劑中所含PCR引物的數量增多，在電泳凝膠上 的“噪聲”也隨之增多。當由于非特異性退火產生PCR產物時，“噪 聲”就會出現。出于此原因，當使用PCR反應時，難以確定不只是僅 少數基因存在。

此外，有必要設計好引物，以使經PCR反應擴增出的PCR產物 在分辨率有限的電泳凝膠上可以辨別。要設計出可產生適當的可分辨 PCR產物且噪聲低的引物并不容易并且耗時。因此，嚴格的基于PCR/ 電泳的方法對于篩選大量基因表達是低效的。

發明概述

本發明涉及用于檢測生物樣品或檢驗樣品中的目標核酸的方法 和檢驗試劑盒。使用寡核苷酸微陣列快速地高通量篩選病原體的存在 情況。寡核苷酸微陣列含有已知病原體的各種聚核苷酸(探針)，并且 以一個雜交測定來鑒別病原體。

一方面，本發明涉及一種簡易而快速地確定生物樣品或檢驗樣品 中是否存在含有目標核酸的多核苷酸的方法。

另一方面，本發明涉及一種用于檢測生物樣品或檢驗樣品中病原 體的目標核酸的方法，所述方法包括：利用與不止一種病原體中的保 守區結合的一對或更多對引物來擴增樣品中的目標核酸；使擴增的目 標核酸與寡核苷酸微陣列接觸；且檢測目標核酸與探針的結合情況， 其中與特定病原體探針結合則表明樣品中存在該病原體。所述微陣列 包括含與不同病原體互補的多核苷酸序列的兩種或以上的探針或者 探針組。

又一方面，本發明涉及一種辨別樣品中的大腸桿菌(E.coli)和沙門 氏菌的方法。所述方法包括：利用與大腸桿菌和沙門氏菌中的保守區 結合的一對或更多對引物擴增樣品中的核酸；使擴增的目標核酸與寡 核苷酸微陣列接觸；且檢測核酸與作為指示樣品中存在大腸桿菌和/ 或沙門氏菌的探針的結合情況。所述微陣列包括含與大腸桿菌和沙門 氏菌中的可變區互補的多核苷酸序列的兩種或以上探針。

在另一方面，本發明涉及一種用于檢測在生物樣品或檢驗樣品中 病原體的目標核酸的試劑盒，所述試劑盒包括：至少一對引物和寡核 苷酸微陣列，所述微陣列包含固定化在固相支持體上的至少一種探 針。

根據以下的說明且結合附圖，并通過例示闡明本發明原理，本發 明的其他方面和優點將顯而易見。

附圖簡述

圖1A和圖1B顯示了16S?rDNA的細菌DNA序列的保守引物區 和可變探針區。

圖2A和圖2B顯示了18S?rDNA的真菌DNA序列的保守引物區 和可變探針區。

圖3是本發明實施方案的圖式概述。

發明詳述

1.病原體