[發明專利]利用以RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白質假型化的慢病毒載體將基因導入呼吸道上皮干細胞

有效

• 申請號: 200680050173.8
• 申請日: 2006-10-27
• 公開（公告）號: CN101351557A
• 公開（公告）日: 2009-01-21
• 發明（設計）人: 見供克之;井上誠;巖崎仁;長谷川護
• 申請（專利權）人: 生物載體株式會社
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;A61K35/76;A61K38/00;A61K48/00;A61P11/00;C12N5/10
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 封新琴;巫肖南

技術領域

本發明涉及一種將基因導入呼吸道上皮干細胞的慢病毒載體，該載體用RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白質假型化。

背景技術

囊性纖維癥(Cystic?Fibrosis：CF)是白種人中最常見的致死性常染色體隱性疾病，此病的原因由囊性纖維癥跨膜轉導調節因子(CFtransmembrane?conductance?regulator：CFTR)基因發生異變引起，由于離子不能跨越呼吸道上皮移動，使粘膜增厚，細菌附著，最終導致發病。因此，呼吸道上皮細胞成為基因治療的重要靶的。

為使導入基因得以長期表達，重要的是要將基因導入到包括干細胞在內的呼吸道上皮細胞前體細胞。所謂干細胞是指具有多分化功能和自我復制能力的未分化細胞。呼吸道的干細胞存在于粘液下腺組織(sub-mucosalgland)的導管上皮(ductal?epitherium)周圍，或基底膜(basement?membrane)的基底細胞(basal?cells)周圍，氣管上皮及基底細胞可以阻斷外部毒素及有害物的侵入(參考非專利文獻1及2)。另外，有報告說，該細胞也散在于小鼠氣管的軟骨組織中(參考非專利文獻1)。一般來說，上皮細胞的干細胞非常少，存在于粘液下腺組織(sub-mucosal?gland)中被隔離的部位，基因導入等方案很困難。包括干細胞在內的呼吸道上皮細胞，由于存在粘蛋白層及粘液，是難以基因導入的組織。

呼吸道上皮細胞具有極性，將接觸外部空氣側稱之為頂側(apical?side)、體腔側稱之為基底外側(basolateral?side)。由于呼吸道上皮細胞的頂側表面沒有病毒受體，幾乎沒有載體可以有效轉導到無傷的呼吸道上皮中。以腺病毒為首，很多病毒受體在基底外側，EGTA及表面活性劑等前處理(pre-conditioning)要在臨基因導入前進行。水皰性口內炎病毒糖蛋白質(VSV-G)假型化慢病毒載體，例如，為有效轉導必須用洗滌劑將上皮表面做前處理。但這些化學處理不可臨床應用。

囊性纖維癥等呼吸系統障害性遺傳疾病中已開發出了基因治療載體及給藥方法。為將基因導入呼吸道上皮細胞，需要通過粘蛋白層及粘液由上皮細胞頂側進行導入。對于從基底外側感染的病毒載體，存在于上皮細胞之間的緊密連接阻礙了這些載體的進入。因此，采取鈣絡合劑EGTA，或其與各種表面活性劑并用的給藥方法，打破緊密連接。然而在人體臨床上，這種方法(pre-conditioning)還是不被看好。

一般用于假型化的VSV-G受體位于呼吸道上皮細胞基底外側，所以基因導入時需要用溶血磷脂膽堿(LPC；表面活性劑的一種)進行處理。LPC處理后將VSV-G假型化HIV載體(搭載基因；LacZ)感染到小鼠鼻腔，導入基因的表達至少持續了92天(參照非專利文獻3)。這個結果啟示我們因為上皮細胞的壽命為3個月，所以基因導入干細胞是可能的。沒有前處理的慢病毒載體的假型化，有報告舉為，埃博拉病毒·扎伊爾株的包膜蛋白質(參照非專利文獻4)。并且在小鼠呼吸道組織中觀察到了搭載LacZ基因可持續表達63天。雖然該實驗的實施期間沒有達到上皮細胞的壽命，但仍能確認基因導入到了據說有干細胞存在的粘膜下腺中。

另外還有以下公開的文獻。

【非專利文獻1】Borthwick等著、Am?J.Respir.Cell?Mol.Biol.、Vol.24、pp662-670、2001年

【非專利文獻2】Engelhardt著、Am?J.Respir.Cell?Mol.Biol.、Vol.24、pp649-652、2001年

【非專利文獻3】Limberis等著、Human?Gene?Therapy、Vol.13、pp1961-1970、2002年

【非專利文獻4】Kobinger等著、Nature?Biotechnology、Vol.19、pp225-230、2001年

【非專利文獻5】Alberto?Auricchio等著、The?Journal?of?ClinicalInvestigation、Vol.110、Number?4、pp.499-504、2002年

【非專利文獻6】John?F.Engelhardt著、The?Journal?of?ClinicalInvestigation、Vol.110、Number?4、pp.429-432、2002年

發明內容

【本發明要解決的課題】