[發明專利]使用粉體來提高轉化效率的方法

有效

• 申請號: 200680046936.1
• 申請日: 2006-12-13
• 公開（公告）號: CN101331227A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發明（設計）人: 石田佑二;樋江井佑弘;植木潤;山本岳
• 申請（專利權）人: 日本煙草產業株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 張平元

技術領域

本發明是關于通過土壤桿菌屬細菌來高效地進行將基因導入到植物材料中的方法。?

背景技術

作為主要谷類的玉米、水稻等單子葉植物的轉化方法，已知有電穿孔法、基因槍法等。然而，這些物理的基因導入法存在將多拷貝的基因導入，基因并不能以完整的形式插入，轉化植物畸形、不育等多種問題。?

根據土壤桿菌法的基因導入，是利用土壤桿菌機能的植物轉化方法。土壤細菌土壤桿菌(Agrobacterium?tumefaciens，根瘤土壤桿菌)具有下列機能：感染植物時，使作為與土壤桿菌病原性相關的Ti(tumor-inducing)質粒的一部分的T-DNA整合到植物基因組中。根據土壤桿菌法的植物轉化方法是下述方法：制備將Ti質粒的T-DNA結構域置換為希望向植物染色體組中導入的基因的轉化用質粒，使用制備成具有以該轉化用質粒代替了Ti質粒的土壤桿菌，通過利用土壤桿菌的上述機能，將希望向該植物染色體組中導入的基因導入到植物染色體組中的方法。?

使用土壤桿菌屬細菌的基因導入法，作為雙子葉植物的轉化法被普遍使用。由于認為土壤桿菌僅以雙子葉植物為宿主，并不寄生在單子葉植物中(DeCleene，M.and?De?Ley，J.，(1976)Bot.Rev.，42：389-466)，進行了關于根據土壤桿菌法轉化單子葉植物的嘗試(Grimsley，N.，等，(1987)Nature，325：177-179；Gould，J.，等，(1991)Plant?Physiol.，95：426-434；Mooney，P.A.，等，(1991)Plant?Cell，Tissues?and?Organ?Culture，25：209-218；Raineri，D.M.，等，(1990)Bio/technology，8：33-38)。據這些研究報告，顯示了在水稻、玉米、小麥等稻科作物中也可以利用土壤桿菌進行基因導入，但每個都存在重現性的問題，除此之外，在導入的基因的確認方面不完全，并未顯示具有說服性的結果(Potrycus，I.，(1990)Bio/technology，8：535-542)。?

Chan等，在2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)共存條件下，將培養兩天的?水稻未成熟胚創傷后，在含有馬鈴薯懸濁培養細胞的培養基中接種帶有nptII基因與GUS基因的土壤桿菌。在添加了G418的培養基上培養處理過的未成熟胚，由被誘導的愈傷組織得到再分化的植物體。據報道，再分化的植物體及其后代的植物體中的GUS基因的存在由southern分析確定再分化當代、后代任何的植物體中都已被確定有導入基因的存在(Chan，M-T.，等，(1993)Plant?Mol.Biol.，22：491-506)。此結果支持了由土壤桿菌對水稻的轉化，但轉化率為1.6％，非常低，相對于供試的未成熟胚數250，顯示為正常生長的再生植物體僅有1個。由于剔除水稻的未成熟胚需要大量的工作，這樣低的轉化率很難說達到實用的標準。?

近年，報道了通過利用帶有強病原性土壤桿菌的一部分病原性基因的超級雙元載體(super?binary?vector)，在水稻、玉米等單子葉植物中也能穩定、高效地轉化(Hiei，Y.，等，(1994)，The?Plant?Journal，Vol.6，p.271-282；以及Ishida，Y.，等，(1996)，Nature?Biotechnology，Vol.4，p.745-750)。根據這些報道，通過土壤桿菌的轉化，可以穩定、高效地轉化，并且所得到的轉化植物變異少，被導入的基因復制數少，而且具有完整形態的植物很多的優點。繼水稻、玉米成功之后，作為主要谷類的小麥(Cheng，M.，等，(1997)Plant?Physiol.，115：971-980)、大麥(Tingay，S.，等，(1997)Plant?J.，11：1369-1376)和高梁(Zhao，Z.-Y.，等，(2000)Plant?Mol.Biol.，44：789-798)的通過土壤桿菌的轉化也有報道。?