[發(fā)明專利]用于檢測(cè)樣品中靶細(xì)胞存在與否的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200680046310.0
• 申請(qǐng)日: 2006-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN101374960A
• 公開（公告）日: 2009-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬克·安格萊斯迪奧里亞克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 簡(jiǎn)珀恩特聯(lián)合股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N5/00;C12N15/10;C12Q1/02
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 劉曉東;顧晉偉

本發(fā)明涉及用于檢測(cè)樣品中靶細(xì)胞存在與否的方法，尤其是用于檢 測(cè)樣品中靶細(xì)菌存在與否的方法，所述方法包括基于核酸的檢測(cè)步驟。

目前使用的許多檢測(cè)樣品中細(xì)胞類型或微生物的方法依賴于DNA 或RNA的鑒定，例如診斷微生物感染、法醫(yī)學(xué)、組織分型和血型分型、 檢測(cè)遺傳變異等。

目前，人們普遍認(rèn)可將使用DNA或RNA鑒定作為一種手段，用于 區(qū)分不同細(xì)胞或細(xì)胞類型，或者區(qū)分相同細(xì)胞類型中含有DNA突變的 變體。因此，更普遍地通過使用抗體鑒定特征性表面抗原來進(jìn)行的HLA 分型也可以替代性地通過鑒定編碼這些抗原的DNA來實(shí)現(xiàn)。微生物感 染或污染可以通過檢測(cè)靶生物的核酸分析來鑒定，而不是依賴于檢測(cè)細(xì) 胞或微生物的表現(xiàn)特征(例如通過形態(tài)學(xué)或生物化學(xué)標(biāo)記來檢測(cè))。遺 傳變異也可通過相似的手段來鑒定。

一般而言，通過在足以確保低水平非特異結(jié)合的條件下與一個(gè)或多 個(gè)寡核苷酸雜交來鑒定DNA或RNA。通常，所述雜交的核苷酸成對(duì)使 用，作為引物用于多種目前可用的體外擴(kuò)增形式中，主要是聚合酶鏈?zhǔn)? 反應(yīng)(polymerase?chain?reaction，PCR)和鏈置換分析(Strand Displacement?Analysis，SDA)，以及連接酶擴(kuò)增反應(yīng)(Ligase Amplification?Reaction，LAR)、自持續(xù)序列復(fù)制(Self-Sustained Sequence?Replication，3SR)和Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增體系。擴(kuò)增后，可通過測(cè) 序進(jìn)一步表征DNA，例如使用Sanger法。擴(kuò)增和測(cè)序可以組合在一起。

基于核酸擴(kuò)增的所有檢測(cè)方法中的一致主題是存在最初的核酸分 離步驟，用于將核酸從可干擾所使用的雜交和/或擴(kuò)增技術(shù)的材料(例 如蛋白質(zhì))中分離出來。

已知一系列用于分離核酸的方法，但是一般而言，它們依賴于一系 列復(fù)雜的提取和洗滌步驟，并且進(jìn)行起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

用于從復(fù)雜的起始材料(如血或血液制品或組織)中分離核酸的經(jīng) 典方法包括用洗滌劑或離液劑裂解生物材料(可能在蛋白質(zhì)降解酶存在 下進(jìn)行)，然后對(duì)核酸用有機(jī)溶劑如苯酚和/或氯仿萃取數(shù)次、乙醇沉淀、 離心和透析。這些方法不僅進(jìn)行起來繁復(fù)費(fèi)時(shí)，而且所需相對(duì)多的步驟 提高了降解、樣品損失或者在同時(shí)處理若干樣品時(shí)樣品交叉污染的風(fēng) 險(xiǎn)。

因此一直在尋求對(duì)核酸分離方法的改進(jìn)。已經(jīng)提出了依賴于使用固 相的方法。例如在US-A-5,234,809中描述了一種方法，其中在離液劑如 胍鹽存在下，核酸與二氧化硅微粒形式的固相結(jié)合，由此與樣品的其余 部分分離。WO?91/12079描述了一種方法，其中核酸通過沉淀停留在固 相表面。一般而言，使用醇和鹽作為沉淀劑。核酸所來源的細(xì)胞可通過 過濾、離心或與附著在固相上的抗體親和結(jié)合而首先從樣品中分離。以 這種方式濃縮細(xì)胞后，接著從濃縮的細(xì)胞中純化DNA，這通常是通過 上述經(jīng)典酚/氯仿抽提法進(jìn)行，也帶有其附帶的缺點(diǎn)。

已經(jīng)描述了其它方法(US-B?1-6,255,477)，所述方法涉及細(xì)胞與第一 固相結(jié)合、裂解這些細(xì)胞和隨后將釋放的核酸與第二固體支持物結(jié)合的 連續(xù)步驟。這些方法已經(jīng)被進(jìn)一步開發(fā)，以使細(xì)胞和釋放的核酸與相同 的固體支持物結(jié)合(WO98/51693和WO?01/53525)。

發(fā)明人已驚訝地發(fā)現(xiàn)，比WO?98/51693中所述簡(jiǎn)單得多的方法也是 有效的。尤其是不需要將釋放的核酸與固體支持物結(jié)合的單獨(dú)步驟，因 而需要更少的試劑和更少的步驟，例如不需要核酸結(jié)合緩沖液。

照這樣，通過進(jìn)行起來簡(jiǎn)單并快捷的程序來確定樣品中靶細(xì)胞的存 在與否，耗時(shí)可少于30分鐘。

因此，本發(fā)明第一方面提供了用于檢測(cè)樣品中靶細(xì)胞存在與否的方 法，所述方法包括：

(a)將所述樣品中的細(xì)胞與微粒狀可混合固體支持物結(jié)合；

(b)將細(xì)胞從該固體支持物上洗脫，而不使用競(jìng)爭(zhēng)分子破壞細(xì)胞與固 體支持物之間的相互作用；

(c)裂解所述細(xì)胞后，檢測(cè)所述靶細(xì)胞特征性的核酸存在與否，

其中所述固體支持物上沒有固定抗體或抗體片段。

檢測(cè)步驟(c)通常包括核酸擴(kuò)增方法。