[發明專利]單性生殖激活人類卵母細胞用于產生人類胚胎干細胞

無效

• 申請號: 200680043279.5
• 申請日: 2006-10-19
• 公開（公告）號: CN101535468A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: E·S·雷瓦佐娃;M·V·普呂茲科娃;L·N·庫茲米喬夫;J·D·賈納斯
• 申請（專利權）人: 國際干細胞公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙蓉民;路小龍

1.產生人干細胞的方法，其包括：

a)單性生殖激活人卵母細胞，其中所述激活包括：i)在高O₂張力下使所述卵母細胞與離子載體接觸，和ii)在低O₂張力下使所述卵母細胞與絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑接觸；

b)在低O₂張力下培育步驟(a)所述的激活卵母細胞，直到胚泡形成；

c)將所述胚泡轉移到飼養細胞層，并在高O₂張力下培養所述轉移胚泡；

d)將內細胞團(ICM)從步驟(c)所述胚泡的滋養外胚層機械地分離出來；和

e)在飼養細胞層上培養步驟(d)所述的ICM的細胞，其中所述培養步驟(e)在高O₂張力下進行。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述低O₂張力通過在包含大約2％?O₂到大約5％?O₂的O₂濃度的氣體混合物環境中孵育而維持。

3.根據權利要求2所述的方法，其中所述氣體混合物環境進一步包括大約5％?CO₂和大約90％?N₂到93％?N₂。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述高O₂張力通過在包含大約5％?CO₂和大約20％?O₂的氣體混合物環境中孵育而維持。

5.根據權利要求1所述的方法，其中所述離子載體選自離子霉素和A23187。

6.根據權利要求1所述的方法，其中所述絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑選自星形孢菌素、2-氨基嘌呤、鞘氨醇、和6-二甲氨基嘌呤(DMAP)。

7.根據權利要求1所述的方法，其中所述激活、分離和培養步驟在的確定成分培養基條件下進行，用于治療應用。

8.根據權利要求7所述的方法，其中所述培養基包括人臍帶血清。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述培養基包括大約10％的人臍帶血清。

10.根據權利要求1所述的方法，其中所述飼養細胞層包括人成纖維細胞。

11.根據權利要求10所述的方法，其中所述成纖維細胞是出生后人皮膚成纖維細胞。

12.根據權利要求10所述的方法，其中所述飼養細胞被抗生素失活。

13.根據權利要求12所述的方法，其中所述抗生素是絲裂霉素C。

14.分離的干細胞，其由權利要求1所述的方法制備。

15.激活人中期II卵母細胞的方法，其包括：

a)在體外受精(IVF)培養基中孵育人中期II卵母細胞；

b)在包含離子載體的IVF培養基中孵育步驟(a)所述的細胞；

c)在包含絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑的IVF培養基中孵育步驟(b)所述的細胞；和

d)在新鮮的IVF培養基中孵育步驟(c)所述的細胞，直到胚泡形成，

其中所述孵育步驟(a)和(b)在高O₂張力下進行，并且其中從步驟(d)所述的胚泡得到的內細胞團(ICM)產生可培養的干細胞。

16.根據權利要求15所述的方法，其中用于孵育步驟(c)和(d)的所述O₂張力通過在包含大約2％?O₂到5％?O₂的O₂濃度的氣體混合物環境中培育所述細胞而維持。

17.根據權利要求16所述的方法，其中所述氣體混合物環境進一步包括大約5％CO₂和大約90％?N₂到93％?N₂。

18.根據權利要求15所述的方法，其進一步包括用透明質酸酶孵育所述卵母細胞。

19.根據權利要求15所述的方法，其中孵育步驟(a)在大約37℃下進行大約2小時。

20.根據權利要求15所述的方法，其中孵育步驟(b)在大約37℃下進行大約5分鐘。