[發明專利]新的酯酶和它們在丁炔醇酯的動力學拆分方法中的用途

有效

• 申請號: 200680031335.3
• 申請日: 2006-10-05
• 公開（公告）號: CN101253262A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發明（設計）人: U·T·博恩朔伊爾;M·施密特;M·克勒;A·列克斯
• 申請（專利權）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12P41/00;C12P7/04;C12P7/62
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;隗永良

發明領域

本發明一般涉及具有酯酶活性的酶和它們在丁炔醇酯(butinolester)的動力學拆分方法中的用途。

發明背景

定向進化在過去的十年里已經出現作為一種強有力的改進生物催化劑的方法^[1]。例如，D-乙內酰脲酶的對映選擇性可以被逆轉從而導致了用于合成光學純L-氨基酸的大大改良的方法^[2]。

Reetz和Jaeger能夠增加來自于銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的脂肪酶對手性羧酸(2-甲基癸酸)的對映選擇性，首次從E＝1.1(野生型)增加到E＝11^[3]。利用一系列分子生物學方法，他們最終能夠鑒定出一種具有實際上有用的選擇性(E＝51)的變體^[4]。類似地，我們通過結合易錯PCR和飽和誘變方法，能夠將來自于熒光假單孢菌(Ps.Fluorescens)的酯酶(PFE)針對3-苯基丁酸的對映選擇性從E＝3.5增加到E＝12^[5]。

成功的定向進化實驗強烈的依賴于幾個方面：對想要的顯示出增強的對映選擇性的變體的鑒定很強地依賴于所使用的高通量篩選方法，因為使用替代底物(即，對硝基苯酯)所確定的選擇性會顯著的不同于真實底物(即，甲酯)，這會導致假陽性變體。此外，認為突變的隨機引入不會顯著的影響生物催化劑的其它特性和它在微生物宿主中的產生。另外一個方面是產生的突變的位置。定向進化實驗常常導致一類變體，在這類變體中，有效的突變遠離活性位點區域，盡管它們影響底物的特異性或對映選擇性，并且更近的突變是否更好的問題也在文獻中提出^[6]。對1a乙酸酯的水解酶催化的拆分非常具有挑戰性，因為這個仲醇的取代基大小只有很小的差異。根據“Kazlauskas規則”^[7]，它僅僅被脂肪酶或酯酶以低至中等的E值轉化。

(R)-醇可以用于合成(-)-akolactone?A——細胞毒性丁內酯(cyctotoxic?butanolide)^[8]，pancrastatin——一種抗腫瘤生物堿^[9]，手性的基于環丙烷的配體^[10]以及用于4-羥基-2-戊炔酸(R)-苯甲酯((R)-benzyl4-hydroxyl-2-pentynoate)的大規模生產^[11]。1a的兩種純的對映異構體用于通過Johnson重排制備對映的和非對映純的烯丙基硼酯(allylboronicester)，產生了對映純的高烯丙醇^[12]。其它的例子包括從α-氨基丙二烯合成3-溴代-吡咯啉^[13]，旋光的二環配體用于合成HIV蛋白酶抑制劑^[14]或α_vβ₃拮抗物(骨質疏松)的重要中間體^[15]。應用(S)-醇的一個例子是手性環狀碳酸酯的制備^[16]。

之前，我們研究了用于1b的動力學拆分的＞100種水解酶^[17]，最好的酶是在大腸桿菌(E.coli)中重組表達的來自于熒光假單孢菌的酯酶(PFE)^[18](SEQ?ID?NO：1)。但是反應時間過程的詳細分析發現，對映選擇性在乙酸酯的水解過程中顯著下降(表1)和觀察到完全的轉化從而導致外消旋的醇1a。在專利中描述了來源于莢殼假單孢菌(Pseudomonas?glumae)的酯酶的類似效果^[19]。在相應的丁酸酯水解中，最初的值是E～30，但是后來也在更高的轉化中下降，使得高產率的拆分不切實際。只有Nakamura和同事報道了可接受的對映選擇性，但是這種小規模的拆分需要使用大量的脂肪酶Amano?AH和非常長的反應時間(2d)^[20]。備選的不對稱的酶促酮還原受到很低的對映體過量阻礙，如來源于短乳桿菌(Lactobacillus?brevis)的NADPH依賴的醇脫氫酶提供(R)-醇的具有60％ee或NADH依賴的近平滑假絲酵母(Candida?parapsilosis)羰基還原酶產生的(S)-醇具有49％ee顯示的那樣^[21]。此外，3-丁炔-2-酮很不穩定，具有熱分解的高風險性，限制了大規模的拆分，即使可以利用高選擇性的還原酶。

發明目的

本發明的目的是為光學純的3-丁炔-2-醇的制備提供高度有效的水解酶，其沒有現有技術中酶的缺點。

發明詳述