[發明專利]使用高通量測序技術對復雜基因組測序的改良策略

無效

• 申請號: 200680030607.8
• 申請日: 2006-06-23
• 公開（公告）號: CN101278058A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: M·J·T·范艾克;A·P·索蘭森;R·C·J·霍格斯
• 申請（專利權）人: 科因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 羅菊華

1.?測定基因組序列的方法，其包含下述步驟：

(a)通過使用至少一種第一限制性核酸內切酶消化基因組提供限制性片段以提供基因組第一亞集；

(b)連接至少一個接頭到第一亞集的限制性片段，以提供接頭連接的限制性片段的第一集合；

(c)為了提供擴增的接頭連接的限制性片段的第一亞集，使用第一引物組合選擇性地擴增接頭連接的限制性片段的第一集合，其中至少第一引物含有互補于接頭和互補于限制性核酸內切酶識別序列一部分的片段，進一步在引物序列3′末端包含第一選擇性的序列，其中第一選擇序列含有1-10個選擇性核苷酸；

(d)為了提供擴增的接頭連接的限制性片段的第二和/或進一步的亞集，使用至少第二和/或進一步引物組合重復步驟(c)，其中引物在它的3′末端，含有不同的第二和/或進一步的選擇的序列；含有相同的選擇性核苷酸數量；

(e)為了產生第一、第二和/或進一步的測序文庫，片段化每個擴增的接頭連接的限制性片段的第一、第二和/或進一步的亞集，隨后進行文庫的選擇性匯集；

(f)確定包含在每個第一、第二和/或進一步的文庫中的(至少部分)片段的(至少部分的)核苷酸序列；

(g)對每個第一、第二和/或進一步的文庫中的片段的序列進行比對，以產生擴增的接頭連接的限制性片段的重疊群，所述擴增的接頭連接的限制性片段來源于代表基因組的分散的級分；

(h)用至少一個第二和/或進一步的限制性核酸內切酶重復步驟(a)-(g)；

(i)為了提供基因組的序列，對于每個第二和/或進一步的限制性核酸內切酶，對在步驟(g)和(h)中獲得的重疊群進行比對。

2.?根據權利要求1的方法，其中第一、第二和/或進一步的限制性核酸內切酶中的至少一個是罕見內切酶。

3.?根據權利要求1或2的方法，其中第一、第二和/或進一步的限制性核酸內切酶中的至少一個是常用內切酶。

4.?根據權利要求1、2或3的方法，其中至少使用2個罕見內切酶。

5.?根據權利要求1-4的方法，其中使用一個罕見內切酶和一個常用內切酶。

6.?根據權利要求1-5的方法，其中擴增方法為PCR，優選地為Lone-Range?PCR。

7.?根據權利要求1-6的方法，其中引物3′末端的選擇的序列含有1-8個選擇的核苷酸，優選地1-5個，更優選地1-3個。

8.?根據權利要求1-7的方法，其中位于引物3′末端的第一、第二和進一步的選擇性序列具有相同的核苷酸數量，但是選擇性序列的核苷酸序列彼此互不相同。

9.?根據權利要求1-8的方法，其中通過Sanger雙脫氧測序法進行測序。

10.?根據權利要求1-8的方法，其中測序是在固相支持物例如珠子上進行的。

11.?根據權利要求1-8的方法，其中測序是基于高通量測序，優選地是合成測序。

12.?根據權利要求1-8的方法，其中測序是基于合成測序，優選地是焦磷酸測序。

13.?根據權利要求1-8的方法，其中測序包含下述步驟：

(f1)把測序接頭連接到片段上；

(f2)退火測序接頭連接的片段到珠子上，每個珠子與單個片段退火；

(f3)乳化油包水微反應器中的珠子，每個油包水微反應器包含單個珠子；

(f4)在珠子表面進行乳化PCR以擴增接頭連接的片段；

(f5)挑選/富集含有擴增的接頭連接的片段的珠子；

(f6)把珠子加載于孔中，每個孔含有單個珠子；

(f7)產生焦磷酸信號。

14.?根據前述權利要求的任一項的方法，其中重疊群的建立進一步通過使用來自于其它資源的核苷酸測序來輔助，所述其它資源包括，但并不局限于BAC末端序列、BAC鳥槍序列、EST序列或完整基因組鳥槍序列。

15.?根據前述權利要求的任一項的方法，其中通過使用限制性核酸內切酶消化基因組制備基因組亞集以提供限制性片段，隨后進行非選擇性擴增。

16.?根據前述權利要求的任一項的方法，其中降低混合物復雜性的方法是基于直接針對于保守基序的索引連接器、CHIP或PCR引物。