[發明專利]具有失活的乳酸脫氫酶基因的修飾微生物

無效

• 申請號: 200680020348.0
• 申請日: 2006-06-07
• 公開（公告）號: CN101223271A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發明（設計）人: A·阿特金森;R·克里普斯;A·湯普森;K·埃利;M·泰勒;D·利克;B·拉德;S·貝克
• 申請（專利權）人: TMO可再生能源有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12P7/06
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術領域

本發明涉及鑒定適用于以細菌發酵產物的形式來生產乙醇的微生物。特別是，本發明涉及利用嗜熱細菌的乙醇生產。

背景技術

根據細菌種類和環境條件，細菌代謝可通過各種不同的機制進行。異養菌，包括所有的病原體，通過氧化有機化合物獲得能量，碳水化合物(特別是葡萄糖)、脂質和蛋白質是最常被氧化的化合物。細菌對這些有機化合物的生物氧化會導致合成ATP作為化學能量來源。該過程也會生成更簡單的有機化合物(前體分子)，這些化合物是細菌細胞進行生物合成反應所需的。細菌代謝適合底物的一般過程是糖酵解，糖酵解是一系列將葡萄糖轉化為丙酮酸并生成ATP的反應。代謝能生成過程中丙酮酸的命運會根據微生物和環境條件而變化。有三種主要的丙酮酸反應。

其一，在有氧條件下，許多微生物將利用檸檬酸循環和將丙酮酸轉化為乙酰輔酶A來產生能量，由丙酮酸脫氫酶(PDH)催化。

其二，在無氧條件下，某些產乙醇生物能夠通過如下過程進行乙醇發酵：將丙酮酸脫羧為乙醛，由丙酮酸脫羧酶(PDC)催化；隨后用NADH將乙醛還原為乙醇，由乙醇脫氫酶(ADH)催化。

第三種反應是將丙酮酸轉化為乳酸，所述反應由乳酸脫氫酶(LDH)催化。

人們對使用微生物進行乙醇生產非常感興趣，使用天然地進行厭氧發酵的微生物或者使用整合了丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因的重組微生物。盡管在使用這些微生物生產乙醇方面獲得了某些成功，但是發酵通常由于乙醇濃度的增加而受到損害，特別是當所述微生物具有低水平的乙醇耐受性時。

已經提出將嗜熱細菌用于乙醇生產，使用嗜熱細菌的好處在于可以在高溫下進行發酵，所述高溫可以使得所生產的乙醇在高于50℃的溫度下以蒸汽形式被移出；這也使得可以使用高糖濃度來進行發酵。然而，找到能有效地生產乙醇的適合的嗜熱細菌尚成問題。

WO01/49865公開了一種被轉化了編碼丙酮酸脫羧酶的異源基因并且具有天然的乙醇脫氫酶功能的革蘭氏陽性細菌，用于乙醇生產。所述細菌為嗜熱的桿菌屬(Bacillus)且該細菌可通過利用轉座子插入的乳酸脫氫酶基因失活來被修飾。WO01/49865中公開的細菌全部來源于桿菌屬菌株LLD-R，一種自發地從培養物中長出的孢子形成缺陷菌株，且在該菌株中ldh基因已經被自發突變或化學誘變所失活。所公開的菌株LN和TN是LLD-R菌株的改良過的衍生菌株。然而，全部的菌株都含有Hae?III型限制性系統，所述限制性系統妨礙質粒轉化并因此阻止非甲基化DNA中的轉化。

WO01/85966公開了通過體內甲基化克服限制性問題而制備的微生物。這要求將Hae?III甲基轉移酶從埃及嗜血桿菌(Haemophilusaegyptius)轉化到LLD-R、LN和TN菌株中。然而，LLD-R、LN和TN菌株是不穩定的突變體并且會自發地回復為產乳酸的野生型菌株，特別是在低pH和高糖濃度的環境中。這會導致發酵產物從乙醇變為乳酸，使得所述菌株不適合用于乙醇生產。

WO02/29030公開了LLD-R菌株及其衍生菌株在ldh基因編碼區包括一個天然存在的插入元件(IE)。將該插入元件轉入(轉出)ldh基因的轉座以及隨后的基因失活都是不穩定的，導致回復。對此給出的解決方案是將質粒DNA整合到所述IE序列中。

因此，在本領域中，用于乙醇生產的微生物的產生依賴于修飾實驗室產生的化學誘變過的桿菌屬微生物、用體內甲基化方法處理這些微生物和進一步修飾所述微生物以便將質粒DNA整合到所述IE序列中。所述方法是復雜和不確定的，且也存在如何使用所述菌株的管理問題。

因此需要改良過的用于乙醇生產的微生物。

發明內容

根據本發明的第一方面，對本文標明為NCIMB編號41277、41278、41279、41280和41281的任一種嗜熱微生物進行修飾以使得乙醇產量增加，所述修飾為失活野生型嗜熱微生物的乳酸脫氫酶基因。

根據本發明的第二方面，一種用于乙醇生產的方法，包括在存在C5或C6糖的適合的條件下，培養根據上述提供的定義的微生物。

根據本發明的第三方面，一種用于修飾微生物以增加乙醇產量的方法，包括獲得NCIMB編號41277、41278、41279、41280和41281的任一個所限定的嗜熱微生物，并且從微生物中缺失乳酸脫氫酶基因。

附圖說明

參照附圖描述本發明，其中：

圖1為puB190和puB190-ldh的質粒圖譜的示意圖。

具體實施方式