[發明專利]自激活抗性蛋白

有效

• 申請號: 200680019552.0
• 申請日: 2006-06-02
• 公開（公告）號: CN101292037A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發明（設計）人: D·J·斯塔爾
• 申請（專利權）人: KWS薩特股份公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C07K14/415
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 郭文潔;梁謀

本發明涉及編碼可在植物中產生針對病原體的抗性的自激活抗性 蛋白的核酸，該核酸在產生轉基因植物的用途以及轉基因植物。

由于植物中抵御或延遲及抑制主要的潛在病原體散播的天然防御 機制不充分，因此由真菌、病毒、線蟲和細菌引起的植物病害在世界范 圍造成極大損失，可影響收獲產品的質量并需要更多更大量使用化學殺 蟲劑。這些防御機制包括超敏反應、感染部位宿主組織的可控死亡、通 過木質化和愈合組織的形成而增強植物細胞壁、形成植物抗毒素及產生 PR(致病相關的)蛋白。植物抗性基因(R基因)是激活誘導型防御機 制的關鍵分子。根據Flohr的基因對基因假說，R基因的蛋白與微生物 無毒基因(Avr基因)的對應蛋白相互作用，從而啟動誘導型防御反應。

根據其編碼的R蛋白的結構可將主要的R基因分為5類(Martin?et al，2003)。1類僅包括編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶的番茄Pto基因。而主要 的植物R基因屬于NBS-LRR基因超家族，它編碼“核苷酸結合位點” (NBS)和“富含亮氨酸的重復”(LRR)。在其N末端具有諸如例如“亮 氨酸拉鏈”這樣的“卷曲螺旋”結構(CC)的NBS-LRR基因可歸為2類 CC-NBS-LRR基因。CC-NBS-LRR型R基因在所有被子植物中均有發 現。3類包括TIR-NBS-LRR型R基因，它在N末端具有取代C結構域 的、與動物TIR區(“toll-interleukin-1受體”)同源的序列。雖然在擬南 芥中，TIR-NBS-LRR基因構成了約75％R基因，但未在草和甜菜中發 現(Tian?et?al.，2004)。

第四類R基因包括番茄的Cf基因。CF蛋白沒有NBS結構域，但 具有跨膜結構域(TM)和胞外LRR。第五類包括水稻的Xa21蛋白，它 由胞外LRR結構域、跨膜結構域和胞內激酶結構域構成。

盡管R基因由R基因啟動子進行弱表達，但1、2和3類R基因的 強組成型表達甚至在沒有相應的無毒基因產物時仍可激活植物的病原 體防御系統，由此導致R蛋白的自激活(Tang?et?al.，1999；Oldroyd?and Staskawicz，1998；Bendahmane?et?al.，2002)。

但通常R基因在轉基因植物中的組成型過表達與諸如植株的微壞 死(Tang?et?al.，1999)或矮小(Frost?et?al.，2004)這樣的農事上不良特 征相關。

2類和3類R蛋白的自激活的另一個可能原因是在全長CC-NBS- LRR，或TIR-NBS-LRR蛋白中特定的、保守的氨基酸元件發生了突變。 在NBS或馬鈴薯Rx基因的LRR結構域(Bendahmane?et?al.，2002)及 亞麻L6基因的NBS結構域(Howles?et?al.，2005)中序列的突變可產生 突變株，在不存在相應無毒基因的情況下，該突變株在瞬時表達后可啟 動細胞死亡。

用Rx基因的缺失實驗表明包含CC結構域和部分NBS結構域的缺 失產物可在其瞬時過表達后啟動細胞死亡，其發生比使用全長R基因的 情況更快。這些缺失產物除了CC結構域外，還需要NBS結構域中的P 環、激酶2以及完整的激酶3a。相反，與全長R基因相比較，NBS的 進一步縮短可導致更慢的HR引發或啟動(Bendahmane?et?al.2002)。

亞麻L10基因，它也是一種3類R基因，其自激活可通過形成縮短 的、含有TIR結構域以及包括P環在內的限制性NBS結構域的34個氨 基酸的TIR-NBS-LRR蛋白來實現(Frost?et?al.，2004)。

雖然已知有多種R基因的自激活方法，但目前仍未報道過其中R蛋 白自激活在導致真菌抗性增強的同時可降低農事上不良特征的轉基因 植物。在亞麻中，嘗試在天然L6抗性基因啟動子或真菌誘導型啟動子 控制下分別穩定轉化兩個L6基因的自激活全長變異體，產生的是正常 生長的真菌敏感型植株，或者是矮小的真菌抗性植株(Howels?et?al.， 2005)。

因此，本發明的目的是改變植物抗病原體的防御能力，從而使植物 的防御反應確實在病原體攻擊時可被激活，但不會對植物的農事特征產 生負面影響。