[發明專利]在宿主細胞中表達克隆的改進方法

無效

• 申請號: 200680008683.9
• 申請日: 2006-03-20
• 公開（公告）號: CN101163790A
• 公開（公告）日: 2008-04-16
• 發明（設計）人: 羅埃爾弗·伯恩哈德·梅瑪;蒂鮑特·喬斯·維恩策爾;科尼利斯·瑪麗亞·雅各布斯·沙吉;約翰尼斯·翰德里克·德溫德;奧斯卡·保羅·柯伊伯斯;魯特格爾·簡·洛爾延范;馬若蘭·科納拉·迪克;布倫達·沃恩克
• 申請（專利權）人: 帝斯曼知識產權資產管理有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 李劍

1.啟動子DNA序列，例如：

(a)以下列表所示的DNA序列：SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQID?NO：20、SEQ?ID?NO：21、SEQ?ID?NO：22、SEQ?ID?NO：23或SEQ?IDNO：24，

(b)能夠與(a)的DNA序列雜交的DNA序列，

(c)與(a)的DNA序列至少50％同源的DNA序列，

(d)(a)到(c)中任何DNA序列的變體，或

(e)(a)到(d)中任何DNA序列的亞序列。

2.DNA構建體，其包含與報告基因可操作連接的如權利要求1所述的啟動子DNA，所述報告基因賦予可選擇性狀，優選地，選擇性標記基因。

3.包含如權利要求2所述的DNA構建體的表達載體，其中所述DNA構建體包含下述DNA片段，所述DNA片段與宿主細胞基因組中預先確定的靶基因座DNA序列同源，優選所述預先確定的靶基因座包含高表達的基因。

4.包含如權利要求2所述的DNA構建體的表達載體，其中所述DNA構建體能夠在宿主細胞中自主維持，優選地，所述DNA構建體包含AMA1序列。

5.宿主細胞，其包含如權利要求2所述DNA構建體，或包含如權利要求3或4所述的表達載體。

6.如權利要求5所述的宿主細胞，其還包含包含下述DNA序列的DNA構建體，所述DNA序列包含來自下述DNA文庫的編碼序列，所述DNA文庫來自被懷疑能夠產生一種或多種目的蛋白質的生物。

7.如權利要求5或6所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞為原核生物或真核生物。

8.如權利要求7所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自以下列表：Bacillus、酵母或絲狀真菌，優選地，Aspergillus、Penicillium或Trichoderma種。

9.如權利要求8所述的宿主細胞，其中Aspergillus為Aspergillus?niger或Aspergillus?sojae或Aspergillus?oryzae種。

10.用于分離下述DNA序列的方法，所述DNA序列包含在宿主細胞中編碼目的蛋白質的DNA序列，所述方法包含如下步驟：

(a)制備第一DNA構建體，其包含與賦予可選擇性狀的報告基因可操作連接的啟動子DNA序列；當所述DNA構建體存在于宿主細胞中和當所述宿主細胞產生目的蛋白質，優選被分泌的目的蛋白質時，所述啟動子DNA序列被誘導；

(b)制備第二DNA構建體，其包含包含下述DNA序列的DNA序列，所述DNA序列編碼來自下述生物DNA文庫的目的蛋白質，所述生物被懷疑能夠制造一種或多種目的蛋白質；

(c)用(a)和(b)中制備的兩種DNA構建體轉化宿主細胞；

(d)在有助于產生所述DNA文庫中存在的目的蛋白質的條件下，培養(c)中獲得的所有經轉化的宿主細胞；和

(e)通過分析在(d)中產生的蛋白質，篩選產生目的蛋白質的經轉化的宿主細胞。

11.如權利要求10所述的方法，其中首先用步驟(a)中制備的DNA構建體轉化所述宿主細胞，然后用步驟(b)中制備的DNA構建體轉化所述宿主細胞。

12.如權利要求10或11所述的方法，其中步驟(a)中使用的所述啟動子為權利要求1的啟動子。

13.如權利要求10到12任一項所述的方法，其中所述被懷疑能夠產生目的蛋白質的生物為真核生物或原核生物。

14.如權利要求10到13任一項所述的方法，其中所述目的蛋白質為酶。