[發明專利]小干擾RNA和包含它的用于治療乙型肝炎的藥物組合物

無效

• 申請號: 200680007650.2
• 申請日: 2006-03-09
• 公開（公告）號: CN101142316A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 金美賢;辛德香;金秀仁;樸萬勛
• 申請（專利權）人: 牧巖生命工學研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/51;C12N15/09
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司
• 代理人: 吳小明

技術領域

本專利申請要求提交于2005年3月9日的美國申請系列號60/660,132的優先權。本申請要求所列申請的權益，將其全文并入本文作為參考。

本發明涉及對乙型肝炎病毒X基因特異的小干擾RNA及其藥用用途。

背景技術

估計全世界有超過3億人被乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染。患有與HBV相關的肝衰竭的患者可能發展肝硬化或肝細胞癌。一種主要的抗HBV治療是用α-干擾素或拉米夫定治療，或用它們進行組合治療。然而，α-干擾素作為抗病毒藥物顯示出一些缺陷，諸如藥效低，副作用和昂貴的費用。拉米夫定，一種核苷類似物，是對HBV逆轉錄酶非常有效的和特異的抑制劑。但是，當在患者中停止治療時，其導致對藥物具有抗性的病毒基因組突變和對病毒復制的再次激活。僅有約20％的HBV患者對用α-干擾素和拉米夫定進行的組合治療有反應。

HBV是一類小的被膜DNA病毒并且屬于肝DNA病毒科(hepadnaviridae)。人的肝臟是HBV的主要的靶器官。HBV感染通常導致嚴重的肝衰竭，諸如慢性肝炎，肝硬化或肝細胞癌。HBV基因組是具有3.2kb的長度的部分雙鏈環狀DNA，其包含四個開放閱讀框，稱為S，C，P和X。基因組DNA的轉錄產生四種大小為3.5(前基因組RNA)，2.4，2.1，和0.7kb(信使RNAs)的不同的病毒RNAs。見圖1(Ganem和Varmus，Annu.Rev.Biochem.，1987，56，651)。前基因組RNA不僅在病毒蛋白質翻譯中而且在病毒DNA通過聚合酶蛋白的逆轉錄中都起著關鍵的作用。核心蛋白包裝部分環狀的DNA和聚合酶蛋白質，隨后進行核殼體裝配。接著，核殼體顆粒與病毒被膜蛋白質相互作用從而形成成熟的感染性病毒體，其在病毒生活周期的最后一個步驟從細胞中分泌出來。

HBV?X(HBx)基因是最小的，長度為465個核苷酸，并且編碼HBx蛋白質，所述蛋白質長度為154個氨基酸并且具有17kDa的分子量(Fujiyama?et?al，Nucleic?Acids?Res.，1983，11，4601)。它是多效的反式作用子，不僅刺激HBV的啟動子和增強子，還通過蛋白質-蛋白質相互作用刺激廣泛種類的其它病毒啟動子(Nakatake?et?al，Virology，1993，195，305；Spandau和Lee，J.Virol，1988，62，427)。而且，HBx蛋白是通過與細胞轉錄因子的相互作用或通過信號轉導途徑誘導細胞轉化和肝腫瘤的關鍵因素(Kekule等，Nature，1993，361，742)。因為HBx蛋白質涉及HBV-介導的HCC，其編碼區包含在所有的四種HBV?mRNAs中，并且在廣泛種類的HBV亞型中是高度保守的，因此HBx基因對于設計和開發抗-HBV?siRNAs一定是理想的靶標。

病毒生活周期可以通過HBV基因組質粒(gene-bank登記號M38636的adr亞型)，pcDNA-HBV1.3的轉染引入病毒復制系統來人工地起始和增殖。見圖2。通過改進以前報道的方法(Guidotti等，J.Virol，1995，69，6158)來發展pcDNA-HBV1.3克隆。HBV基因組質粒的轉染導致體外病毒RNAs和蛋白質的表達。還可以應用其來構建體內小鼠模型系統，其中通過將攜帶HBV基因組的裸質粒DNA流體動力學注射到小鼠的尾靜脈中來實現完全的免疫應答和病毒的復制以及成熟病毒顆粒的裝配。這是通過實驗模擬和誘導病毒復制周期并通過檢測病毒蛋白質或觀察病毒核酸來監測抗病毒藥物的功效的有力的工具。例如，將HBV完整質粒和siRNA或其表達載體共注射導致在肝和血清中病毒抗原、轉錄物和復制DNA水平上的顯著抑制(Giladi，Molecular?Therapy，2003，8，769；McCaffrey，Nat.Biotechnol，2003，21：639)。

同時，RNA干擾(RNAi)是在進化上保守的進程，其中(內源和外源)基因表達在所有的真核生物中通過雙鏈RNA(dsRNA)的引入而受到抑制。RNAi被稱作切酶的RNase?III-樣核酸內切酶所起始，其促進長的dsRNAs連續切割為21-23nt的短的干擾RNAs(siRNAs)(Bernstein等，Nature，2001，409，363)。SiRNAs結合到RNA誘導性沉默復合物(RISC)中，其在ATP存在的情況下解開siRNA(Hammond，等，Nature，2000，404，293)。結合到RISC中的反義RNAs識別同源RNAs并且在細胞胞質區指導它們的降解。