[發(fā)明專利]用于改進(jìn)多核苷酸序列特征的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200680006772.X
• 申請(qǐng)日: 2006-03-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101142324A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: P·萊克索
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 靈維泰公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于提高多核苷酸序列表征的準(zhǔn)確性的方法。

背景技術(shù)

用于表征分子或其生物學(xué)反應(yīng)的技術(shù)改進(jìn)在一定程度上推動(dòng)了分子研究的進(jìn)展。特別是，對(duì)核酸DNA和RNA的研究就受益于序列分析和雜交反應(yīng)研究方面的技術(shù)發(fā)展。

通常用于大規(guī)模DNA測(cè)序的主要方法是鏈終止法。該方法最初由Sanger和Coulson(Sanger?et?al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977；74：5463-5467)所開(kāi)發(fā)，該方法有賴于四種核苷酸的雙脫氧衍生物的使用，所述雙脫氧衍生物在聚合酶反應(yīng)中被摻入到新生多核苷酸鏈中。一旦摻入，雙脫氧衍生物就會(huì)終止聚合酶反應(yīng)，然后，通過(guò)凝膠電泳分離產(chǎn)物，并對(duì)其進(jìn)行分析以揭示具體雙脫氧衍生物摻入鏈中的位置。

盡管所述方法被廣泛使用并且可獲得可靠的結(jié)果，但是人們也認(rèn)識(shí)到該方法速度慢、勞動(dòng)強(qiáng)度大且費(fèi)用昂貴。

US-A-5302509公開(kāi)了一種對(duì)固定在固體支持物上的多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法。所述方法有賴于在DNA聚合酶的存在下，將具有不同熒光標(biāo)記的3’-封閉堿基A、G、C和T摻入至所固定的多核苷酸。聚合酶可摻入與靶多核苷酸互補(bǔ)的堿基，但是卻被3’-封閉基團(tuán)阻止進(jìn)一步加入。然后測(cè)定所摻入堿基的標(biāo)記，并通過(guò)化學(xué)斷裂除去封閉基團(tuán)，使得發(fā)生進(jìn)一步聚合。但是，這種需要去除封閉基團(tuán)的過(guò)程耗費(fèi)時(shí)間，并且必須高效進(jìn)行。

WO-A-00/39333描述了一種通過(guò)將靶多核苷酸序列轉(zhuǎn)換成第二種多核苷酸來(lái)對(duì)多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法，所述第二種多核苷酸之中含有確定的序列和位置信息。據(jù)報(bào)道靶標(biāo)的序列信息在第二種多核苷酸中“放大”，從而使得可更容易地區(qū)分靶分子中的單個(gè)堿基。這可通過(guò)使用“放大標(biāo)簽”來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述“放大標(biāo)簽”為預(yù)定的核酸序列單元。靶分子上的每種堿基即腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤和胸腺嘧啶用各自的放大標(biāo)簽表示，由此將原始靶序列轉(zhuǎn)換為放大的序列。接下來(lái)再利用常規(guī)技術(shù)測(cè)定放大標(biāo)簽的順序，并由此確定靶多核苷酸的具體序列。

在一種優(yōu)選的測(cè)序方法中，每個(gè)放大標(biāo)簽包括一個(gè)標(biāo)記，例如一個(gè)熒光標(biāo)記，該標(biāo)記可以隨后被鑒定并且用于表征該放大標(biāo)簽。

WO-A-04/094664描述了WO-A-00/39333所公開(kāi)的轉(zhuǎn)換方法的一種改進(jìn)方法。在兩種方法中，優(yōu)選每個(gè)放大標(biāo)簽包括具有獨(dú)特序列的兩個(gè)單元，所述序列可用作一個(gè)二元系統(tǒng)，其中一個(gè)單元表示“0”，另一個(gè)表示“1”。靶標(biāo)上的每個(gè)堿基由這兩個(gè)單元的組合表征，例如，腺嘌呤可用“0”+“0”表示，胞嘧啶可用“0”+“1”表示，鳥(niǎo)嘌呤可用“1”+“0”表示，胸腺嘧啶可用“1”+“1”表示。

和所有的測(cè)序方法一樣，對(duì)于成功的測(cè)序反應(yīng)來(lái)說(shuō)，維持高的準(zhǔn)確率非常重要。因此獲得任何測(cè)序反應(yīng)的最高準(zhǔn)確率是一種長(zhǎng)期需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種提高測(cè)序反應(yīng)的準(zhǔn)確性的方法，所述反應(yīng)特別是涉及使用二元信號(hào)的測(cè)序反應(yīng)，例如WO-A-00/39333和WO-A-04/094664中所描述的測(cè)序反應(yīng)(二者皆通過(guò)引用的方式納入本說(shuō)明書(shū))，或者是涉及堿基到堿基信號(hào)的測(cè)序反應(yīng)，例如連接鄰近測(cè)定法(ligation?proximity?assay)。本發(fā)明基于這樣一種認(rèn)識(shí)：當(dāng)測(cè)序反應(yīng)涉及將一個(gè)靶分子例如一個(gè)多核苷酸轉(zhuǎn)換為一個(gè)包含具有獨(dú)特的序列信息單元的多核苷酸時(shí)，所獲得的序列數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性可以通過(guò)將確定序列摻入該多核苷酸來(lái)提高，所述確定序列可用作可以被測(cè)定的內(nèi)部對(duì)照以確保可檢測(cè)出測(cè)序錯(cuò)誤。這些對(duì)照序列并不直接表示所述靶多核苷酸的序列。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，一種鑒定一個(gè)靶分子的至少一個(gè)特征的方法包括下列步驟：

(i)將所述至少一個(gè)特征轉(zhuǎn)換為一個(gè)信號(hào)多核苷酸序列；并

(ii)鑒定所述信號(hào)多核苷酸序列，從而鑒定所述靶分子的所述至少一個(gè)特征，其中每個(gè)信號(hào)多核苷酸序列包括限定了所述信號(hào)多核苷酸序列的一個(gè)特征的至少一個(gè)對(duì)照序列，而且其中對(duì)所述對(duì)照序列的鑒定可確認(rèn)所述信號(hào)多核苷酸序列是否已被正確地鑒定，并且任選地，如果該鑒定是不正確的，則所述鑒定可提供必要的信息以確定所述正確的信號(hào)多核苷酸序列應(yīng)為何序列。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，一種對(duì)一個(gè)靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法包括下列步驟：

(i)將所述靶多核苷酸的至少一個(gè)堿基轉(zhuǎn)換為一個(gè)信號(hào)序列；并