[發(fā)明專利]不含選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680001710.X
• 申請日: 2006-01-03
• 公開（公告）號: CN101098966A
• 公開（公告）日: 2008-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: G·提索特;M·杜巴爾德;J·－M·費呂略
• 申請（專利權(quán)）人: 拜爾農(nóng)科股份有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 徐迅

本發(fā)明涉及不含選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體(transplastomic)植物、獲得 這種植物的方法和所用載體。

植物轉(zhuǎn)基因由將源自各種生物(細菌、病毒、昆蟲、植物)的一種或多 種基因引入植物組成，其目的是為該植物提供新特性或提高某些農(nóng)業(yè)或食 品質(zhì)量。隨著常規(guī)基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，大量的各種基因已經(jīng)導(dǎo)致新的植 物品種的產(chǎn)生。在某些情況下，由于引入了產(chǎn)生除草劑抗性、病原體抗性 或各種應(yīng)激抗性的特征，可有利于農(nóng)作物生產(chǎn)并提高產(chǎn)量。在其它情況下， 可提高該植物的營養(yǎng)價值和某些基礎(chǔ)化合物的含量。

許多用于獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)包括將外來基因引入該植物 的核基因組。然而，整合入宿主植物核染色體的外來基因可通過花粉散布 給野生種類。因此，降低轉(zhuǎn)基因散布到環(huán)境中的風(fēng)險的方法是非常有益的。

獲得轉(zhuǎn)基因植物的另一種方式是直接轉(zhuǎn)化質(zhì)體。具體說，質(zhì)體轉(zhuǎn)化有 許多優(yōu)點，其中可注意：

-通過雙同源重組將基因插入各個細胞中存在的一個或多個拷貝的環(huán) 狀質(zhì)體基因組(或質(zhì)體組)的質(zhì)體轉(zhuǎn)化具有通過位于轉(zhuǎn)化載體中轉(zhuǎn)基因任一 側(cè)的質(zhì)體序列將感興趣的基因精確靶向至質(zhì)體組中所需區(qū)域的優(yōu)點。這種 精確靶向避免了核轉(zhuǎn)基因過程中通常所觀察到的“位置”效應(yīng)。

-每個細胞獲得非常大量拷貝的轉(zhuǎn)基因。具體說，根據(jù)發(fā)育階段，葉 片細胞可含有高達10000個拷貝的120-160千堿基的小環(huán)狀基因組，每個 分子攜帶一個大的重復(fù)序列。隨后可操作植物細胞，以使其含有高達20000 個拷貝的感興趣基因。

這導(dǎo)致高水平表達；轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可能占總可溶性蛋白質(zhì)的40％以上 (De?Cosa等，2001)。

-質(zhì)體轉(zhuǎn)化具有其它優(yōu)點，它能大大限制轉(zhuǎn)基因散布到環(huán)境中的風(fēng)險。 由于質(zhì)體中所編碼的特征通常不能通過花粉傳播，限制了轉(zhuǎn)基因傳播給野 生物種的潛在風(fēng)險。

McBride等(1994)的文章；美國專利號5,451,513；5,545,817；5,545,818 和5,576,198以及國際專利申請WO95/16783和WO97/32977描述了質(zhì)體 轉(zhuǎn)化技術(shù)。最初在單細胞藻類萊茵衣藻(Chlamydomonas?reinhardtii)中用生 物射彈進行質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Boynton等，1988)，此方法已經(jīng)延伸至煙草(Svab等， 1990)。

常規(guī)的質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)包括用連接有DNA的微粒轟擊葉片(Svab等， 1993)。

目前，僅在煙草植物普通煙草(N.tabacum)中進行高等植物質(zhì)體的穩(wěn) 定轉(zhuǎn)化(Svab和Maliga，1990；Svab等，1993)。然而近年來，水稻(Khan 和Maligna，1999)、擬南芥(Arabidopsis?thaliana)(Sikdar等，1998)、馬鈴 薯(Sidorov等，1999)、油菜籽(Chaudhuri等，1999)和番茄(Ruf等，2001) 的質(zhì)體轉(zhuǎn)化取得了一些進展。獲得了煙草、番茄、馬鈴薯和大豆的可繁殖 的轉(zhuǎn)質(zhì)體植株(WO04/053133)。

直接質(zhì)體轉(zhuǎn)化已經(jīng)用于獲得對除草劑具有良好耐受水平或?qū)ハx的 抗性，或者產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)。因此，煙草質(zhì)體組的除草劑如草甘膦(Daniell， 1998；WO99/10513；Ye等，2000；WO01/04331，WO01/04327)或草胺 膦(Basta)(Lutz等，2001)的耐受基因過度表達產(chǎn)生了對這些除草劑出色的 耐受性。其它應(yīng)用導(dǎo)致產(chǎn)生對昆蟲耐受或過量產(chǎn)生治療性蛋白的轉(zhuǎn)質(zhì)體植 物(McBride等，1995；美國專利5,451,513；Staub等(2000)；WO99/10513)。

然而，如常規(guī)進行的高等植物質(zhì)體的直接轉(zhuǎn)化的一個主要缺點是采用 抗生素抗性基因作為選擇性標(biāo)記。

通常用于選擇轉(zhuǎn)質(zhì)體品系的選擇性標(biāo)記是細菌基因aadA，它在質(zhì)體 調(diào)控元件的控制下表達(Svab等，1993；Staub等，1993)。編碼氨基糖苷3’- 腺苷轉(zhuǎn)移酶的aadA基因的表達產(chǎn)生兩種抗生素抗性，即壯觀霉素和鏈霉 素抗性。aadA基因產(chǎn)物防止壯觀霉素(或鏈霉素)結(jié)合于質(zhì)體核糖體30S亞 基的部件16S?RNA(參與識別翻譯起始密碼子)，從而防止了抑制質(zhì)體內(nèi)的 翻譯。僅有含有表達aadA基因產(chǎn)物的質(zhì)體的細胞能夠繼續(xù)在體外最優(yōu)地 生長并保持綠色。另一種選擇性標(biāo)記是具有點突變的16S?RNA序列，此點 突變使其對壯觀霉素不敏感。