[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號外源插入基因和側(cè)翼水稻序列的連接區(qū)序列及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410081007.0
• 申請日: 2014-03-06
• 公開（公告）號: CN103834645A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宛煜嵩;梁利霞;張秀杰;朱禎;金蕪軍;苗朝華;李亮;黃衛(wèi)紅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京康思博達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11426
• 代理人: 余光軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因水稻的側(cè)翼序列，尤其涉及轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號插入基因載體和側(cè)翼水稻序列的連接區(qū)序列及其應(yīng)用，屬于轉(zhuǎn)基因水稻品系特異性的檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著轉(zhuǎn)基因植物的廣泛種植，轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題也引起人們極大的關(guān)注，已有30多個(gè)國家相繼實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度，包括中國。轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度的實(shí)施依賴于對轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品的成分檢測。PCR技術(shù)是目前國內(nèi)外檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中應(yīng)用最廣泛的方法。在應(yīng)用這種技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物定性檢測時(shí)，根據(jù)其特異性，將其分為篩選檢測法、基因特異性方法、構(gòu)建特異性方法和品系特異性方法。品系特異性檢測是通過檢測插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實(shí)現(xiàn)的，由于每一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，和前三種方法比較，品系特異性具有更高的特異性和準(zhǔn)確性，最適合做轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測。

目前，已有部分專利和文獻(xiàn)報(bào)道了轉(zhuǎn)基因植物的品系特異性檢測方法。例如：張大兵等人于2006年建立了轉(zhuǎn)基因MON863玉米的品系特異性檢測方法；謝家建等人建立了轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻、Bt汕優(yōu)63、科豐6號和科豐8號等一系列品系特異性檢測方法；盧長明等人于2007年建立了一系列轉(zhuǎn)基因油菜的品系特異性檢測方法。但是，目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號的品系特異性PCR檢測方法。確定外源插入基因和側(cè)翼水稻序列的連接區(qū)序列是建立轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號的品系特異性PCR檢測方法的前提。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是獲取轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號外源插入基因載體和側(cè)翼水稻序列的連接區(qū)序列；

本發(fā)明的目的之二是將獲取轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號外源插入基因載體和側(cè)翼水稻序列的連接區(qū)序列作為靶基因應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號品系特異性的定性檢測。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號品系中插入的目的基因?yàn)镾CK基因（SEQ?ID?No.1）通過Hi-TAIL?PCR獲得外源插入基因5’端水稻側(cè)翼序列和3’端水稻側(cè)翼序列，最終所獲得的含有SCK基因的外源插入基因載體及其兩側(cè)5’端和3’端側(cè)翼水稻序列的連接區(qū)核苷酸序列為SEQ?ID?No.2所示；本發(fā)明進(jìn)一步根據(jù)科豐2號外源插入載體和5’端水稻側(cè)翼序列形成的5段連接區(qū)序列設(shè)計(jì)了5對轉(zhuǎn)化體引物，這5對轉(zhuǎn)化體引物雖然均能特異性地從科豐2號樣品中擴(kuò)增出特異性片段，但是在華恢1號，抗優(yōu)97，遼粳371，MON89788，H7-1等水稻品種也均有擴(kuò)增條帶，所以采用這些連接區(qū)作為靶基因設(shè)計(jì)的特異性引物檢測的特異性不好。

本發(fā)明進(jìn)一步根據(jù)科豐2號外源插入載體和3’端水稻側(cè)翼序列所形成的連接區(qū)核苷酸序列（SEQ?ID?No.13）設(shè)計(jì)5對轉(zhuǎn)化體特異性引物，5對引物的核苷酸序列分別為SEQ?ID?No.3-SEQ?ID?No.12所示，應(yīng)用常規(guī)的PCR反應(yīng)條件，分別采用5對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)置2個(gè)重復(fù)；從擴(kuò)增結(jié)果可見，這5對引物均能特異性地從科豐2號樣品中擴(kuò)增出預(yù)期片段，但是用SEQ?ID?No.7和SEQ?ID?No.8所示的引物擴(kuò)增的條帶最為清晰；SEQ?ID?No.7和SEQ?ID?No.8所示的引物是以SEQ?ID?No.13所示的外源插入載體和3’端水稻側(cè)翼序列所形成的連接區(qū)核苷酸序列為靶基因所設(shè)計(jì)的一對特異性檢測引物，這說明以SEQ?ID?No.13所示的連接區(qū)核苷酸序列能夠作為轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號品系特異性檢測的靶基因，例如，以該靶基因設(shè)計(jì)檢測引物，能夠準(zhǔn)確的對轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號品系特異性進(jìn)行定性檢測。

因此，本發(fā)明進(jìn)一步將所獲取的轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號外源插入基因和側(cè)翼水稻序列的連接區(qū)序列應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號的品系特異性的定性檢測，包括：（1）提取待檢測水稻樣品的DNA；（2）以SEQ?ID?No.2或SEQ?ID?No.13為靶基因設(shè)計(jì)特異性檢測引物，建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；（3）如果從待檢測的樣品中擴(kuò)增出預(yù)期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品是轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號；如果從待檢測的樣品中未能擴(kuò)增出預(yù)期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉(zhuǎn)基因水稻科豐2號。

其中，所述的從待檢測水稻樣品中提取DNA的方法，可以是從植物材料中提取DNA的各種常用方法，例如可以是CTAB法、異硫氰酸胍法或鹽酸胍法等各種方法。