[發明專利]編碼多小片段RNA載體在基因干擾與基因激活中的應用

無效

• 申請號: 200610166612.3
• 申請日: 2006-12-31
• 公開（公告）號: CN101210267A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發明（設計）人: 封江南;李超;黃俊;吳瓊杉;余銘恩;孫永林;廖桂紅;嚴俊
• 申請（專利權）人: 國營武昌造船廠
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/63;A61K48/00
• 代理公司: 武漢開元專利代理有限責任公司
• 代理人: 夏惠忠

技術領域

本實用新型涉及生物技術，特別涉及RNA干擾和RNA激活技術。尤其涉及將編碼多條(2條或以上)小片段RNA的載體中用于對同一或不同基因的激活，或是用于對不同基因分別進行基因干擾和基因激活的應用。

背景技術

RNA干擾技術1998年被發現，2001年5月被成功用于哺乳動物細胞，開始了RNA干擾技術的廣泛應用。RNA干擾技術是利用21nt或29nt的雙鏈RNA對目的基因進行封閉，達到干擾目的基因的作用。RNA干擾是生命最為古老的基因免疫監視機制。生命維持健康、抗御病毒侵入、抗腫瘤發生以及維持遺傳穩定等等都可能是依靠RNA干擾實現的，所以，對RNA干擾的研究和RNA干擾技術的應用受到空前的矚目。RNA干擾技術成功應用當年(2001年)就排在納米技術之后被評為世界十大技術進步的第二位。2002年又被評為十大技術進步的第一位。RNA干擾技術正在飛速發展，2001年5月第一次哺乳動物細胞應用時是采用的化學合成的雙鏈RNA，一年后推出了生物轉錄合成的雙鏈RNA，2003年以后越來越多的人開始使用質粒載體表達的雙鏈RNA。

一直以來，科學家認為RNA分子只能引起RNA干擾現象，即抑制基因表達。我國科學家，現任美國加州大學舊金山分校助理研究員李龍承博士于2006年首次證實RNA分子在人細胞中還具有基因激活功能，它能命令細胞在短時間內大量生產某個“有利”基因，比如在癌細胞中的抑瘤基因，從而達到治療疾病的目的。

11月3日出版的美國著名《科學》周刊對該發現詳細地做了介紹。同日，這一成果的論文發表在《美國科學院院刊》雜志上?！犊茖W》周刊評價說：“如果該研究得到進一步確認，這項技術將成為一種強有力的生物學研究工具，而且一些疾病將得到全新治療方法，比如癌癥治療。

用“RNA干擾”治療某一腫瘤時需要有明確的致癌基因作為攻擊目標，但不是所有的腫瘤能找到致癌基因；而“RNA激活”則可以通過選擇性的激活或增強某個抑瘤基因的表達，來遏制腫瘤生長，但同樣的問題則是并非所有的腫瘤能找到抑癌基因。所以具體采用哪一種方案，則要依問題的具體情況而定。

此外在許多應用環境中僅針對單一位點或是單獨應用的“RNA干擾”或“RNA激活”往往效果不理想或是作用有限，特別是在某些代謝途徑中存在多個環節，或是多個替代途徑時，對單一環節的調節或是僅僅對一個途徑的調節往往不足以達到預期目的。在這些情況下，一種能夠將這兩種機制的效果加強或是將兩種機制結合起來的方案，將更有利于將RNA的調節作用應用于科研及醫療領域。

發明內容

本發明的目的是高效穩定地制備能夠同時編碼多條小片段RNA的載體，并將其

(1)應用于同一或不同基因的激活，以期達到對關鍵基因表達的有效激活；或

(2)用于對多個基因分別進行干擾或激活；

(3)無論是針對單一基因或是多個基因，也無論是用于RNA干擾或是RNA激活在，對于每個目的基因都可以有多個小片段RNA與其作用來降低篩選周期或是增強調節效果。

實現本發明的技術方案是：

(1)根據應用目的來確定目的基因的調節方案(干擾或激活)并設計每個基因所對應小片段RNA的數量，按照文獻或經典設計原則選取各自的靶位點。

(2)化學合成編碼各小片段RNA所需的DNA模板并構建入多小片段RNA表達載體中。

(3)將構建的多小片段RNA表達載體根據需要用合適的方式應用于實驗對象(如細胞、組織或是活體)并測定應用結果。

本發明的有益效果：

(1)本發明中對任意基因的調節作用既可以是干擾也可以是激活，從而更有利于利用現有的基因研究成果，將小片段RNA的調節機制應用于科研或臨床，即當前只要已知一個或數個和研究或疾病相關的基因時，無論它們是有正面作用還是負面作用，用本發明方法都可以有效利用這些信息對有正面作用的進行激活，對有負面作用的進行干擾。

(2)因當前RNA技術領域的局限，要達到有效的RNA干擾或激活，往往需要設計多個靶位點進行篩選；而將本發明提供的編碼多小片段RNA載體應用于RNA干擾或激活時，同時多片段的應用可以減少篩選難度，在大多數情況下甚至可以避免篩選過程而一次達到預期效果，這對于當前成本高昂的生物科研及應用而言，可以顯著降低科研成本及周期。

(3)當將多個篩選有效的RNA片段構建在同一載體時，其干擾或激活效果往往因協同作用而較之單一片段有所增強，特別是在幾個片段單獨作用效果都不是很高時這種增強效果尤其明顯。