[發(fā)明專利]辣根過氧化物酶基因與血管內(nèi)皮生長因子基因的連接及克隆

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610164442.5
• 申請日: 2006-12-05
• 公開（公告）號: CN101195829A
• 公開（公告）日: 2008-06-11
• 發(fā)明（設計）人: 邵金輝
• 申請（專利權(quán)）人: 邵金輝
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/12;C12N15/53;C12N1/21
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技術(shù)領域：

本發(fā)明涉及一種具有殺傷腫瘤細胞作用的融合蛋白質(zhì)的基因構(gòu)成，具體涉及人血管內(nèi)皮生長因子基因與辣根過氧化物酶基因的連接及克隆。

背景技術(shù)：

許多酶和前體藥物被用于殺傷腫瘤細胞，并且取得了很多成功。辣根過氧化物酶正在被用于殺滅腫瘤細胞。吲哚-3-乙酸(IAA)作為一種普遍存在的植物生長激素，可被辣根過氧化物酶催化形成活性氧攜帶分子，包括活性氧自由基(ROS)，自由基會導致脂質(zhì)過氧化，引起細胞膜結(jié)構(gòu)改變，導致細胞內(nèi)損傷和凋亡，從而產(chǎn)生動物細胞毒性作用。又由于IAA不能被動物細胞內(nèi)源性過氧化物酶氧化，對正常細胞的生長無影響，因此，可以成為酶介導抗癌藥物治療的候選藥物。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能與血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)特異性結(jié)合，是刺激血管內(nèi)皮細胞增殖和移行的重要因子，并可影響血管通透性。VEGF受體表達高的細胞其VEGF檢出率高于受體表達低的細胞，提示了VEGF多集中在與靶細胞結(jié)合的部位，腫瘤血管對VEGF的反應要比正常血管強。

利用VEGF或VEGF的單克隆抗體與VEGFR或VEGF結(jié)合，阻斷VEGF與受體的結(jié)合，達到抑制其促進血管生長的作用，發(fā)揮抗腫瘤的效應。使用抗體中和VEGF可間接抑制腫瘤的生長。可溶性VEGF受體能特異地結(jié)合VEGF，間接阻斷VEGF與其受體作用。Drake等在鳥胚胎內(nèi)注入可溶性VEGFR1，結(jié)果導致胚胎血管畸形和大血管生成障礙。

將VEGF與小分子毒性物質(zhì)結(jié)合后，通過VEGF與腫瘤血管內(nèi)皮細胞及腫瘤表面受體的特異性結(jié)合，發(fā)揮抑制血管形成及殺瘤效應。Arora等將白喉毒素分子DT390分別與VEGF165和VEGF121結(jié)合。發(fā)現(xiàn)兩者均可抑制表達VEGFR的人臍靜脈內(nèi)皮細胞及卡波西肉瘤細胞的生長，且DT390?VEGF165的作用是DT390VEGF121的3～4倍，對不表達VEGFR的主動脈平滑肌細胞、成纖維細胞和B細胞則無毒性作用。兩者均有明顯抑制腫瘤生長的作用。

VEGF受體flt-1/VEGFR-1和Flk-1/KDR/VEGFR-2在腫瘤組織中表達量很高，通過融合的方法將VEGF165或VEGF121與白喉毒素(DT)制成靶向的有毒物質(zhì)，兩個融合蛋白對繁殖中的內(nèi)皮細胞有高度的毒性作用，而對血管平滑肌細胞無毒性作用，與只用毒素的對照組相比，用VEGF和毒素的融合產(chǎn)物對腫瘤組織有明顯的抑制作用。

在本項研究中，將辣根過氧化物酶基因與VEGF基因進行連接與克隆，以為表達有生物活性的融合蛋白做準備。將用甲醇酵母表達系統(tǒng)進行表達，以表達出產(chǎn)量高而且有生物活性的融合蛋白，用于殺滅腫瘤細胞。

發(fā)明內(nèi)容：

首先獲得血管內(nèi)皮細胞生長因子基因與辣根過氧化物酶基因，然后將二者通過小分子連接肽基因進行連接，再連接到畢赤酵母的表達載體pPIC9K上，在大腸桿菌中進行克隆，通過測序鑒定所構(gòu)建重組基因的正確性。本重組基因可用于表達具有腫瘤細胞殺傷作用的融合蛋白質(zhì)。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

1.目的基因的獲得：辣根過氧化物酶基因的獲得是通過首先提取辣根的基因組DNA，以其為模板進行PCR，得到目的基因。

血管內(nèi)皮細胞生長因子基因的獲得是根據(jù)VEGF165基因序列進行引物設計與合成，提取病人肺腫瘤組織總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄獲得相應cDNA，然后以其為模板進行PCR，獲得VEGF165基因。

2.目的基因的連接與克隆：將兩種目的基因通過連接肽Ser?Ser?Ser?Gly?Ser?Ser?Ser?Ser?Gly?Ser的相應DNA序列連接，在重組基因的3′連上表達六個連續(xù)組氨酸的堿基序列，以便于用鎳柱進行分離純化。連接到pPIC9K上，保持正確的閱讀框，構(gòu)建成重組表達載體。經(jīng)DNA測序和酶切鑒定正確后，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌，以克隆重組表達載體。

附圖說明：

插入目的基因的重組質(zhì)粒的酶切及PCR鑒定圖

1?1Kb?DNA?Ladder?DNA分子量標準物

2空載體的EcoRI和SalI酶切產(chǎn)物

3含目的基因的重組載體的EcoRI和SalI酶切產(chǎn)物

4以重組載體為模板的目的基因的PCR產(chǎn)物

5?DL2000?DNA分子量標準物

具體實施方式：

實施例1辣根過氧化物酶基因片段的擴增