[發明專利]一種均相熒光免疫檢測領域新型熒光物質組合技術

無效

• 申請號: 200610162640.8
• 申請日: 2006-12-01
• 公開（公告）號: CN101191798A
• 公開（公告）日: 2008-06-04
• 發明（設計）人: 王珊珊
• 申請（專利權）人: 王珊珊
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

熒光免疫檢測技術

技術背景：

均相熒光免疫檢測法(homogeneous?fluroimmunoassay，HFIA)是基于熒光共振能量轉移(fluorescence?resonance?energy?transfer，FRET)原理發展的一種新的免疫檢測技術。常用的方法是用二個熒光物質分別標記同一抗原的二個抗體，其中一個熒光物質(供體)的發射光波長與另一個熒光物質(受體)的激發光波長相互重疊。當同把二個熒光標記抗體加入到反應液中，用雙抗體夾心法檢測待測抗原。如果待測樣品中含有目的抗原，會發生抗原、抗體反應，形成抗原、抗體復合物，供體熒光物質與受體熒光物質緊密接觸。這時采用熒光檢測儀或時間分辨熒光檢測儀檢測反應液熒光信號，用短波長紫外光激發供體熒光，就會發生FRET。供體發射的熒光能進一步激發受體分子發射出更長波長的熒光。這樣不僅可以增強熒光信號，并且可以降低背景熒光，減少非特異性熒光的干擾，顯著提高信噪比。這是因為，(1)供體產生熒光后，再激發受體產生熒光，有放大熒光信號的作用。(2)受體熒光一般波長較長，多為紅光或紅外光。而樣品中本底熒光物質在受到紫外光激發后波長位移沒有這么大，多為綠色光和黃色光，并會迅速衰減。因此，長波長熒光信號不受非特異性熒光的干擾，信噪比較高。此外，均相免疫檢測法是在抗原、抗體反應后，直接檢測反應液的熒光信號，省卻了酶聯免疫檢測法(ELISA)需要反復孵育和洗板等煩瑣的操作步驟，也相應地避免了許多人為操作因素和試劑、環境等外界因素的干擾，操作簡單，檢測時間短，穩定性和重復性較好，能較真實地反映被測物質的含量。

傳統的熒光染料激發光和發射光波長之間的Stokes位移較小，僅有30-80nm，常有部分重疊，較易受到非特異性熒光干擾。現在熒光FRET技術通常采用鑭系元素銪(Eu)、锝(Tb)等作為供體熒光材料，激發光波長和發射光波長之間Stokes位移較大，超過250nm，如Eu的激發波長為340nm，最大發射波長為615nm，二者相差290nm，激發光譜和發射光譜沒有重疊，可避免非特異性熒光的干擾。鑭系離子螯合物經紫外光激發后不僅強度高，而且半衰期長(比普通的熒光物質半衰期長5-6個數量級)，穩定性好(低溫條件可保存三年)，非常適合于抗原、抗體標記，因而成為二十一世紀最熱門的熒光材料。

在均相熒光免疫檢測技術中，通常將標記抗體的熒光物質制備成納米顆粒。然后再標記相應的抗體或抗原。這樣，既可以減少熒光物質的泄漏，也可以增強熒光物質的穩定性。當抗原、抗體發生反應形成抗原、抗體復合物時，熒光納米顆粒緊密接觸，在受到激發光刺激后，通過納米顆粒間發生的FRET，顯著增強熒光信號。這種技術目前廣泛應用于蛋白或半抗原的免疫熒光檢測或制備微型生物傳感器。

目前，均相熒光免疫檢測技術常用的熒光物質配伍組合是銪(Eu)或锝(Tb)與Cy5、Cy3或藻紅蛋白等組合方式。Eu的最大激發光為340nm，最大發射光為615nm，Cy5的最大激發光為643nm，最大發射光為670nm。Eu發射光與Cy5發射光之間仍有部分重疊，本底熒光還比較高，影響均相熒光免疫檢測的靈敏度和信噪比。

參考文獻：

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