[發明專利]煙草黃瓜花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方法

無效

• 申請號: 200610160020.0
• 申請日: 2006-12-30
• 公開（公告）號: CN101210924A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發明（設計）人: 高玉千;邱立友;梁振普;戚元成
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: G01N33/544
• 分類號: G01N33/544;G01N33/532
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司
• 代理人: 趙磊

技術領域

本發明屬于檢測材料，尤其涉及一種煙草黃瓜花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方法。

背景技術

煙草黃瓜花葉病在我國各產煙區均有發生，近年來危害逐步重于普通花葉病，在河南、山東、陜西、四川、黑龍江、遼寧等省每年都造成較大的經濟損失，是我國重要的病毒病之一。黃瓜花葉病毒(Cucumber?mosaic?virus，CMV)的核酸是三分體線狀正鏈ssRNA，主要在越冬蔬菜、多年生雜草上越冬，來年春天由帶毒有翅蚜蟲刺吸煙葉，形成初侵染，田間通過蚜蟲和摩擦接觸形成再侵染。侵染煙草初期僅表現心葉脈明、花葉等癥狀，嚴重者后期則表現為整株矮化，上部葉花葉、畸形，下部葉壞死紋、壞死斑等出現。

目前煙草花葉病毒病的檢測方法有電鏡法和血清學法兩種。電鏡法是檢測病毒最可靠最有效，主要有負染法和組織超薄切片法，可以直接觀察到病毒的形態特征、內部結構及病毒混合感染的情況。血清學法需要制備完整病毒的抗血清，用各種血清反應方法進行檢測。

但這兩種方法都需要將樣品中病毒或核酸提取和純化，需要超高速離心機以及電子顯微鏡等設備，雖然血清學法特異性比較強，但在病毒濃度較低時，制備的抗血清效價不高，檢測效果不理想。因此需要有一個快速簡便、可靠性高的檢測方法來進行檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種煙草黃瓜花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方法，有這種試紙條可快速簡便地進行檢測，且可靠性高。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：一種煙草黃瓜花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方法，包括制備抗體、制備膠體金、制備膠體金-抗體結合物、制備硝酸纖維素膜和制備膠體金層析檢測試紙的步驟，在制備抗體的步驟中，要制備兔多克隆抗體：用無菌生理鹽水將煙草黃瓜花葉病毒抗原稀釋為2mg/ml，然后加Freund’s佐劑，第一次為完全佐劑，以后用不完全佐劑；抗原注射量為0.1～0.2mg/kg，選用2～3Kg的兔子，采取靜脈注射方式，分三次完成，每次注射抗原用量0.03～0.1mg，間隔時間為10d，末次注射10d后進行放血，放血前動物禁食12h，采用耳靜脈放血40～60ml，收集后離心除去血細胞，純化后零下20℃保存；并用同樣的方法制備羊抗兔抗體。

在制備膠體金的步驟中，取1％氯金酸0.6ml在30ml超純水中加熱煮沸，快速一次加入37℃預溫的1％檸檬酸鈉0.9ml，溶液由藍逐漸變為紫紅色，煮沸3～5min，補水至30ml；冷卻到室溫后，用0.2mol/L的碳酸鉀調pH至7.2～7.5，然后用0.22μm濾膜進行過濾，制備20～30nm膠體金顆粒。

在制備膠體金-抗體結合物的步驟中，取1mg純化的煙草黃瓜花葉病毒抗體，邊攪拌邊注入到50ml膠體金溶液中，室溫下攪拌1h，然后加10％牛血清蛋白2ml，室溫下攪拌5min，再加10％聚乙二醇1ml，室溫下攪拌5min，12000～15000rpm離心50min，沉淀溶于5ml保存液中，用0.45μm濾膜過濾，4℃保存。

在制備硝酸纖維素膜的過程中，將3ml膠體金-抗體結合物和3ml?TBS緩沖液混勻，放入硝酸纖維素膜(NC膜)浸泡10mln，取出在37℃烘箱中烤干，熱合封口，4℃保存備用；然后將煙草黃瓜花葉病毒的兔多克隆抗體和羊抗兔抗體分別用固相溶液稀釋成3mg/ml和1mg/ml，兩種抗體分別取1μl，依次點樣在NC膜上，即檢測線和質控線，固相抗體NC膜在0.5％BSA封閉液中，37℃下孵育1h后，洗滌液中洗2次，室溫下風干，4～8℃保存。

在制備膠體金層析檢測試紙的步驟中，取一塊潔凈的PVC板，將包被的NC膜固定在適當的位置上，將引水材料連接在NC膜的下端，吸水材料連接在NC膜的上端，膠體金-抗體結合物硝酸纖維素膜置于引水材料下與NC膜銜接，用切割機將組裝后的PVC板縱向切成6mm寬的測試條，將其裝入板殼即可。

采用上述技術方案制備的煙草黃瓜花葉病毒田間快速檢測試紙條，檢測適溫15～35℃，檢樣量0.1～0.3g的樣品，相當于葉面積大約3～5cm²；將煙葉在裝有緩沖液的塑料袋中研磨后，將試紙條浸入，30min出結果；假陽性率低于1％。可見本發明使用方便，特別適用于田間快速檢測，并且可靠性很高。

具體實施方式

實施例1：