[發(fā)明專利]煙草S期激酶蛋白1基因序列及其編碼蛋白質(zhì)序列和應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610155823.7
• 申請日: 2006-12-29
• 公開（公告）號: CN101210251A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發(fā)明（設計）人: 杜昱光;張付云;白雪芳
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/82;A01N65/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發(fā)明涉及S期激酶相關蛋白1基因，具體地說是一種來源于抗病煙草品種枯斑三生煙(Nicotiana?tabacum?var.Samsun?NN)的煙草S期激酶蛋白1基因序列及其編碼蛋白質(zhì)序列和應用。

背景技術

S期激酶相關蛋白1(S-PHASE?KINASE-ASSOCIATED?PROTEIN1，SKP1)是真核生物(煙草)中普遍存在的一類蛋白，是泛素連接酶3SCF復合體的核心亞單位。近幾年來研究發(fā)現(xiàn)，SCF介導的泛素系統(tǒng)在茉莉酸信號途徑和R-基因介導的抗性等生物反應過程中均有作用，但具體通路尚不太清楚，尤其是在殼寡糖的誘抗中的作用尚無報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種煙草S期激酶蛋白1基因序列及其編碼蛋白質(zhì)序列和應用。

一種煙草S期激酶蛋白1基因序列，具有序列表中SEQ?ID?NO.1堿基序列。

所述的煙草S期激酶蛋白1cDNA基因序列的編碼蛋白，具有序列表中SEQ?ID?NO.2編碼的氨基酸序列。

應用基因序列的殼寡糖誘導植物抗性反應，從而可將所述基因序列用于制備生物農(nóng)藥。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點：

1.真核生物煙草中普遍存在的一類蛋白，是泛素連接酶3SCF復合體的核心亞單位，與煙草的抗病毒活性相關，分子量為17527.78Da，等電點4.57，定位于細胞質(zhì)，其Skp1結(jié)構(gòu)域位于4-105位氨基酸。

2.對生物農(nóng)藥的應用具有明顯指導作用；該基因的克隆對于揭示殼寡糖誘導植物抗性反應的分子信號通路很有價值，并在寡糖生物農(nóng)藥的應用方面具有重要的理論指導意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明S期激酶相關蛋白1(SKP1)根據(jù)衍射數(shù)據(jù)得到三緯結(jié)構(gòu)模型圖。

具體實施方式

S期激酶相關蛋白1(S-PHASE?KINASE-ASSOCIATED?PROTEIN1，SKP1)是真核生物(煙草)中普遍存在的一類蛋白，是泛素連接酶3SCF復合體的核心亞單位。近幾年來研究發(fā)現(xiàn)，SCF介導的泛素系統(tǒng)在茉莉酸信號途徑和R-基因介導的抗性等生物反應過程中均有作用，功能上具有多樣性，調(diào)節(jié)過程廣泛；煙草SKP1是在殼寡糖處理條件下特異表達的，因此與殼寡糖誘導的植物抗性信號傳導有著密切的關系。

實施例1

1.煙草(枯斑三生煙)的S期激酶相關蛋白1基因的cDNA的克隆及序列

1)50mg/L的殼寡糖噴施煙草葉片，噴水作對照，分別在8h和168h取樣提取總RNA進行DDRT-PCR，將差異片段回收并亞克隆后，測序獲得3′端序列，該片段與本塞姆氏煙草的SKP1(S-PHASEKINASE-ASSOCIATED?PROTEIN1)基因同源性為82％。

2)利用CLONTECH公司的試劑盒獲得枯斑三生煙草的SKP1基因的5′端及cDNA的全長，進而推導出氨基酸序列。

3)可被殼寡糖誘導的枯斑三生煙草SKP1具有以下cDNA堿基(參見序列表1)和蛋白質(zhì)的氨基酸序列(參見序列表2)。

煙草S期激酶相關蛋白1基因(SKP1)的cDNA序列特征：基因組序列：653bp，核苷酸、線性雙鏈，最初來源枯斑三生煙草(Nicotiana?tabacumvar.samsun?NN)；

煙草S期激酶相關蛋白1基因(SKP1)的氨基酸序列特征：線性、單鏈、155氨基酸。

4)根據(jù)枯斑三生煙SKP1基因的cDNA全長序列和pET-23b(+)的特點，設計SKP1基因原核表達的PCR引物序列，分別在引物skp1es和skp1ea的5′端引入了Nde?I和Xhol?I酶切位點(下劃線部分)，另在下游引物的酶切位點后面去掉目的基因的終止密碼子以產(chǎn)生融合有His標簽的融合蛋白，引物序列入下：SKP1上游表達引物(skp1es)5′CGGCCCATATGTCCTCCTCAAAGATGATC?3′；SKP?1下游表達引物(skp1ea)5′GCCGCCTCGAGCTCAAATGCCCAAGCATT?3′，以枯斑三生煙草總RNA為模板擴增待表達的基因片段，克隆到表達載體pET-23b(+)上，轉(zhuǎn)化表達菌株BL21(DE3)誘導表達，表達出與預期蛋白相符的目的蛋白，且該蛋白的大量表達可以抑制大腸桿菌的增殖，因此該蛋白具有一定的抑菌活性，可增強植物的抗病性。