[發明專利]一種誘導植物抗病促生的抑制素蛋白及基因序列

無效

• 申請號: 200610152200.4
• 申請日: 2006-09-19
• 公開（公告）號: CN101148675A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發明（設計）人: 邱德文;曾洪梅;楊秀芬;劉崢;張寧;董健伸;趙明治;劉文平;袁京京
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/195;C12N15/63
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地說是通過分子生物學技術手段，克隆了細極交鏈孢菌(Alternaria?tenuissima)的抑制素基因(phb)，并表達出對植物具有抗病促生作用的抑制素蛋白(Prohibitin)。

背景技術

抑制素基因(phb)是一種有效的腫瘤抑制基因，廣泛分布于細菌、植物、酵母、原蟲及哺乳類等各種生物細胞中。它所編碼的抑制素蛋白(Prohibitin)結構高度保守、具有多種功能，既存在于線粒體內膜上，發揮分子伴侶作用，也存在于細胞核內，具有負性轉錄調控作用，因而對細胞生長、分化、衰老以及細胞凋亡等諸多方面發揮著重要的調控作用。抑制素的命名源于歷史的原因，最早只發現了這些多功能蛋白的一種功能，即作為細胞增殖的抑制子的功能，所以將其命名為抑制素。

抑制素是一類非常重要的蛋白，一直以來對它的研究主要集中在醫學領域，研究材料多為動物細胞；植物中抑制素類似蛋白的研究在玉米、水稻、煙草和擬南芥中也有報道，但其生物功能尚不清楚。最近，在矮牽牛中有抑制素的報道，當下調矮牽牛中抑制素的表達時，矮牽牛的葉和花變小，并且形狀不規則；同時，抑制素基因沉默使矮牽牛花的細胞、花期、呼吸作用均和對照有較大差異，說明抑制素改變了矮牽牛的發育和衰老。因此，抑制素在植物的發育和衰老中也起重要作用。

目前，國內外尚未見絲狀真菌抑制素的報道，也沒有將絲狀真菌產生的抑制素用于誘導植物抗病性、提高植物免疫力的專利或報道。因此，對交鏈孢菌抑制素及其新功能的發現將補充和完善對抑制素的研究，并對生命現象進行新的解釋，還有助于拓展其在農業上的應用，為人類充分利用這一蛋白開展有益的嘗試。

發明內容

本發明的目的是提供一種對植物抗病促生、提高植物免疫力的抑制素蛋白，從而拓展抑制素在農業上的應用。

本發明的主要技術方案是：通過從細極交鏈孢菌的cDNA文庫中克隆抑制素基因，將其在畢赤酵母和大腸桿菌中表達，得到有生物活性的抑制素蛋白。

本發明的抑制素蛋白具有對植物抗病促生、提高植物免疫力的作用。

具體技術方案如下：

(1)采用Gateway^技術，構建細極交鏈孢菌cDNA入門文庫和表達文庫。通過LR重組把入門文庫轉換為表達文庫。

(2)采用細極交鏈孢菌激活蛋白免疫兔子，獲得抗體；采用免疫學方法篩選細極交鏈孢菌cDNA表達文庫，篩選和克隆到一段包括起始密碼子和終止密碼子在內的849bp的完整編碼序列。在NCBI?GenBank中比對發現，在已知蛋白中，該核苷酸序列推測的氨基酸序列和酵母(Saccharomyces?cerevisiae)線粒體內膜上的抑制素復合體(Phb1p-Phb2p)亞基高度同源，其一致性(Identities)為79％，相似性(Positives)為89％。因此，將此基因命名為phb(見序列表)。

(3)PCR擴增phb基因，并在引物中引入限制性內切酶的酶切位點；將phb基因克隆到表達載體的相應酶切位點中，在畢赤酵母或大腸桿菌中表達細極交鏈孢菌的抑制素蛋白(見序列表)；純化表達的抑制素蛋白。

(4)用10-20ug/ml的蛋白溶液中浸泡植物種子或噴施植物葉片，生物測定法測定交鏈孢菌抑制素蛋白的抗病促生活性。

本發明的優點和效果：

本發明的抑制素蛋白是由絲狀真菌細極交鏈孢菌的抑制素基因編碼的，對植物具有明顯的抗病促生作用。與化學農藥相比，本發明無毒、不污染環境，可作為一種無公害的生物農藥，對于保護生態環境，促進農業可持續發展有著重要意義。

具體實施方式

下面通過具體實例進一步說明本發明特點。

實施例1

本實施例采用Gateway^技術，構建細極交鏈孢菌cDNA入門文庫和表達文庫。