[發(fā)明專利]抗腫瘤特異性標志蛋白TS/MEDP的抗體制備及用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610150095.0
• 申請日: 2006-10-26
• 公開（公告）號: CN101168566A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂有勇;許小青;李文梅;梁云燕;樊曉軍;王代樹
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市腫瘤防治研究所
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/53
• 代理公司: 北京天昊聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 羅會英;劉榜美

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及多種細胞和分子生物學技術(shù)，包括細胞同步化技術(shù)、mRNA差異顯示技術(shù)、RACE技術(shù)、原核表達蛋白質(zhì)、RT-PCR、mRNA原位雜交、多克隆抗體制備、免疫化學、Western?blot、流式細胞、RNAi和動物實驗。。

背景技術(shù)

世界上與腫瘤相關(guān)的疾病中，胃癌占第二位，并且是亞洲人群中最常見的惡性腫瘤，嚴重的危害著人類的健康。人們期望能闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展機制，從而有效的預防和治療這一惡性腫瘤。盡管大量的研究證實胃癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)包括飲食、環(huán)境以及細菌或病毒感染，如幽門螺旋桿菌的感染，近年來分子機制研究發(fā)現(xiàn)眾多基因參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，如E-cadherin表達的缺失、p53基因、TGF-β、c-met、erbB-2和RUNX3等，這些研究解釋了胃癌部分發(fā)病機制，對于胃癌的詳細的分子發(fā)病機制我們還知之甚少。

與正常細胞相比，腫瘤細胞的最根本的特征之一就是細胞周期調(diào)控異常，正常細胞向惡性細胞轉(zhuǎn)化過程中，多基因變異積累賦予了腫瘤細胞特有的功能，如腫瘤細胞產(chǎn)生許多自身的生長因子，對于抑止細胞生長的信號不敏感，逃避凋亡，具有無限的復制潛能，均能歸結(jié)到變異的基因?qū)е录毎芷谡{(diào)控異常，特別是細胞周期checkpoint異常，從而賦予腫瘤細胞失控性生長的特性。盡管Cyclin和CDK的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)闡明了細胞周期的基本調(diào)控機制，對于G1-S期checkpoint也有了較多的了解，如P53、P21、GADD45、TGF-β、P27、P16、Rb、E2F參與G1-S期checkpoint的調(diào)控，但是距我們對于認識細胞周期調(diào)控的詳細分子調(diào)控機制還甚遠。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是綜合利用上述技術(shù)，需要找到參與與胃癌發(fā)生發(fā)展，并且參與細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵基因，從而闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，進一步篩選到胃癌分子標志物及治療胃癌的分子靶點。此項研究將mRNA差異顯示技術(shù)和細胞同步化技術(shù)結(jié)合，以胃癌細胞系BGC823為研究對象，獲得了一個周期差異性表達基因，將其全長mRNA克隆并命名為TS/MDEP，提交至Genbank，基因號為DQ150361，TS/MDEP基因編碼389aa蛋白質(zhì)，分子量42.3kd，生物軟件預測包含多個磷酸化位點，一個可與具有SH3?Domain的蛋白質(zhì)結(jié)合脯氨酸富集區(qū)，一個與CC結(jié)構(gòu)域，因此推測TS/MDEP基因具有重要的生物學功能。

基因差異性表達提示其具有特定的生物學功能，因此我們采用不同的技術(shù)，在細胞和組織水平驗證了TS/MEDP基因的表達特征，此基因在14/17株腫瘤細胞中表達，并且呈現(xiàn)周期特異性表達，TS/MEDP蛋白在M期的BGC823中表達最高，隨著細胞分裂的完成，其表達量逐漸降低。更重要的是在配對的胃癌組織中表達，而正常胃粘膜中未見表達，還證實TS/MEDP基因在多種細胞增殖旺盛的胚胎組織中表達，因此TS/MEDP基因在組織中具有如下表達特征：TS/MDEP在細胞增值旺盛的胚胎組織高表達，成年后組織細胞中此基因被關(guān)閉，在腫瘤細胞中又出現(xiàn)高表達，符合癌基因的表達規(guī)律，因此TS/MEDP基因是一個新的候選癌基因。

特別是在BGC823中RNAi干擾TS/MEDP基因后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細胞增殖受到明顯抑制，細胞集落形成能力和致瘤性顯著降低，并且干擾后細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯。這一結(jié)果表明TS/MEDP基因在參與細胞增殖調(diào)控和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的生物學功能。并且可能成為預測胃癌生物學行為的分子標志物。

本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容是：克隆了周期依賴性表達的新基因TS/MEDP(TumorSpecificity?and?Mitosis?Phase-dependent?Expression?protein)，提交到Genebank接受號為DQ150361。通過合成多肽并與大分子蛋白質(zhì)KLH連接后，免疫新西蘭白兔，ELISA測定抗體滴度后，取兔血清，并用原核表達的TS/MDEP蛋白質(zhì)進行親和層析，細胞周期和腫瘤特異性表達，經(jīng)過純化制備了抗TS/MEDP的特異性多克隆抗體。

此抗體可以通過Western?blot和免疫組織化學技術(shù)，檢測到TS/MEDP蛋白的表達。

通過檢測基因的表達，發(fā)現(xiàn)其在細胞及組織中的表達規(guī)律，在細胞中呈現(xiàn)周期特異性表達，TS/MEDP蛋白在M期的BGC823中表達最高，隨著細胞分裂的完成，其表達量逐漸降低，在組織中，TS/MDEP在細胞增值旺盛的胚胎組織高表達，更重要的是，TS/MEDP基因在胃癌組織中表達，而正常的胃粘膜不表達。