[發明專利]重組日本七鰓鰻口腔腺分泌L－250蛋白抗凝血功效

有效

• 申請號: 200610134683.5
• 申請日: 2006-12-08
• 公開（公告）號: CN101195656A
• 公開（公告）日: 2008-06-11
• 發明（設計）人: 李慶偉;孫晶;吳毓;王繼紅;白潔
• 申請（專利權）人: 遼寧師范大學
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;A61K38/17;A61P7/02;C12N15/12;C12N15/63;C12N1/21
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技術領域

日本七鰓鰻口腔腺分泌具組胺釋放因子活性的TCTP模體蛋白-L-250的基因克隆與表達屬于生物技術領域。涉及日本七鰓鰻口腔腺分泌L-250蛋白的cDNA序列及克隆，與其對應的蛋白質氨基酸序列及其在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達，及L-250蛋白作為組胺釋放因子，刺激嗜堿性粒細胞釋放組胺。組胺能增強血管內皮細胞表面表達凝血酶調節素TM，一方面它能與凝血酶結合，降低凝血酶活性；另一方面能夠活化蛋白C，從而觸發抗凝血級聯反應。這提示，L-250蛋白的組胺釋放因子活性在抗凝及心腦血管疾病治療方面具有潛在的應用價值。

背景技術

日本七鰓鰻(Lampetra?japonica)系圓口綱(Cycpostomata)、七鰓鰻目(Petromyzoniformes)、七鰓鰻科(Petromyzontidae)、七鰓鰻屬(Lethenteron)。在進化上因連接著脊椎與無脊椎動物而具有極高的研究價值。在海水中營半寄生生活，以其特有的口吸盤吸附在其他魚類軀體上，靠吸食其血肉生存，并使宿主流血不止，提示在其口腔腺中存在某種抗凝機制。

血管內壁主要存在兩種抗凝機制，分別為蛋白酶類凝血抑制機制和蛋白酶抑制劑類抑制機制。在蛋白酶類凝血抑制機制中，蛋白C起主要作用。蛋白C(PC)為絲氨酸蛋白酶，是由肝臟分泌的一種生理性抗凝劑，它以酶原形式存在于血漿中，PC在自然狀態下是無活性的，經凝血酶的激活，可成為活化的蛋白C(APC)。APC通過使已活化的VIII因子、V因子等凝血因子滅活，從而抑制凝血過程。然而，凝血酶對PC的激活是相當慢的、凝血酶只有與存在于內皮細胞膜表面的血栓調節蛋白，又叫做凝血酶調節素(TM)形成復合物后，才能有效地激活PC。TM是內皮細胞膜上的凝血酶受體之一，與凝血酶結合，會降低凝血酶活性，并加強凝血酶激活蛋白C的作用。因此，TM是使凝血酶由促凝轉向抗凝的重要的血管內凝血抑制成份。

翻譯控制腫瘤蛋白(Translationally?controlled?tumor?protein，TCTP)又叫做組胺釋放因子，被認為在慢性過敏性疾病中起重要作用。該家族蛋白具有2個特征結構域，即TCTP-1([IFAE]-[GA]-[GAS]-N-[PAK]-S-[GTA]-E-[GDEV]-[PAGEQV]-[DEQGAV]和TCTP-2([FLIV]-x(4)-[FLVH]-[FY]-[MIVCT]-G-E-x(4，7)-[DENP]-[GAST]-x-[LIVM]-[GAVI]-x(3)-[FYWQ])，這2個區域在不同物種間具有高度的序列同源性。1995年MacDonald等首次發現了這一蛋白家族的細胞外生物學功能，通過對過敏病人體液中和遺傳過敏癥兒童淋巴細胞中存在的Ig-E依賴性組胺釋放因子進行氨基酸末端序列分析，發現組胺釋放因子與小鼠和人的翻譯控制腫瘤蛋白具有同源性，TCTP能夠刺激人嗜堿性粒細胞釋放組胺，人血吸蟲和瘧原蟲等多種寄生蟲可分泌TCTP至宿主血液中，刺激宿主細胞釋放組胺，從而影響宿主免疫應答。此外，組胺還能夠引起血管擴張效應，增強局部血流；使血管內皮細胞表面凝血酶調節素TM的表達增高，它一方面能與凝血酶結合，降低其活性；另一方面能夠活化蛋白C，活化的蛋白C能夠阻礙凝血因子Xa與血小板的結合，并刺激纖溶酶原激活物的釋放而促進纖維蛋白溶解，還能在其輔因子蛋白S的作用下滅活凝血因子Va和VIIIa，這三條通路最終都能夠引起抗凝血反應的發生。本發明首次發現了存在于日本七鰓鰻口腔腺中的TCTP模體蛋白新基因，并將其命名為L-250，而且本項目的日本七鰓鰻口腔腺中TCTP模體蛋白-L250具有組胺釋放因子活性，能夠刺激嗜堿性粒細胞釋放組胺，從而引發一系列抗凝血級聯反應的發生，提示L250蛋白將在臨床抗凝治療方面具有應用價值。

發明內容

本項發明在日本七鰓鰻口腔腺cDNA文庫中發現了L-250蛋白的開放閱讀框，經對其mRNA全長的進行釣取、測序、及cDNA克隆，對其重組蛋白在大腸桿菌中進行高效誘導表達。L-250重組蛋白生物學活性涉及作為組胺釋放因子，刺激嗜堿性粒細胞釋放組胺。

本發明涉及日本七鰓鰻口腔腺分泌L-250蛋白的cDNA序列及克隆、與之對應的蛋白質序列及其在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達，及其刺激嗜堿性粒細胞釋放組胺的生物學活性，以及抗凝血方面的應用。