[發(fā)明專利]同時檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定其藥物抗性的方法及所用材料

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610130976.6
• 申請日: 2006-12-26
• 公開（公告）號: CN101210265A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A·S·加塞達(dá)特勒夫;A·Y·索博勒夫;D·A·格亞杜諾夫;S·A·拉帕;V·M·米卡伊洛維奇;A·D·米爾加貝科夫
• 申請（專利權(quán)）人: 俄羅斯科學(xué)院V·A·恩格爾哈特分子生物學(xué)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 胡國群

1.一種用于在臨床樣品中同時檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定導(dǎo)致微生物對利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的分枝桿菌DNA突變的方法，其包括：

(A)-使用一組用于第一PCR步驟的特異性引物對，多重?cái)U(kuò)增rpoB、katG、inhA、ahpC基因、IS6110可動因子的片段；

(B)-使用在步驟(A)中獲得的PCR產(chǎn)物作為模板、和一組用于第二PCR步驟的特異性引物對來多重?cái)U(kuò)增rpoB、katG、inhA、ahpC基因、IS6110可動因子的片段，其中每對引物中有一個引物被熒光標(biāo)記以獲得主要是單鏈熒光標(biāo)記的片段；

(C)-制備能夠同時檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定導(dǎo)致對利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的突變的生物芯片，所述生物芯片由具有膠墊的基質(zhì)組成，每個墊中固定有獨(dú)特的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸的序列選自如下序列：a)與野生型rpoB基因片段序列相應(yīng)的序列；b)與導(dǎo)致微生物對利福平產(chǎn)生抗性的突變型變體rpoB基因片段序列相應(yīng)的序列；c)與a)和b)中描述的序列互補(bǔ)的序列；d)與野生型katG基因片段序列相應(yīng)的序列；e)與導(dǎo)致微生物對異煙肼產(chǎn)生抗性的突變型變體katG基因片段序列相應(yīng)的序列；f)與d)和e)中描述的序列互補(bǔ)的序列；g)與野生型inhA基因片段序列相應(yīng)的序列；h)與導(dǎo)致微生物對異煙肼產(chǎn)生抗性的突變型變體inhA基因片段序列相應(yīng)的序列；i)與g)和h)中描述的序列互補(bǔ)的序列；j)與野生型ahpC基因片段序列相應(yīng)的序列；k)與導(dǎo)致微生物對異煙肼產(chǎn)生抗性的突變型變體ahpC基因片段序列相應(yīng)的序列；1)與j)和k)中描述的序列互補(bǔ)的序列；m)與可動因子IS6110的序列相應(yīng)的序列；o)與描述于m)中的序列互補(bǔ)的序列；

(D)-在能為雜交時形成的區(qū)配和錯配的雙鏈體之間提供一個核苷酸的分辨率的條件下，在生物芯片上讓在步驟(B)中獲得的擴(kuò)增出的標(biāo)記產(chǎn)物雜交；

(E)-記錄和解析雜交數(shù)據(jù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在多重PCR的第一步驟(A)中使用的該組特異性引物對的序列為SEQ?ID?NO：70、71、74、75、77、78、80、81、83、84。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在多重PCR的第二步驟(B)中使用的該組特異性引物對的序列為SEQ?ID?NO：72、73、74、76、77、79、80、82、83、85。

4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在多重PCR的第二步驟(B)中使用的熒光標(biāo)記的引物相對于來自該引物對的另一引物來說是摩爾過量的，以便對于所有引物對都獲得主要是單鏈熒光標(biāo)記的片段。

5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中基因和可動因子IS6110的片段的擴(kuò)增直接使用來自臨床樣品的材料(痰、滲出物、洗出液、支氣管肺泡灌洗液)或微生物的初步生長培養(yǎng)物來進(jìn)行。

6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，使用的生物芯片包含具有由SEQ?ID?NO：1-69所示序列的固定的寡核苷酸組。

7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于使用雜交緩沖液，該緩沖液允許在擴(kuò)大的溫度區(qū)間內(nèi)進(jìn)行雜交以便為雜交時形成的匹配和錯配的雙鏈體之間提供一個核苷酸的分辨率。

8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于使用便攜式熒光分析儀和軟件進(jìn)行步驟(E)中的數(shù)據(jù)記錄，所述軟件允許進(jìn)行信號強(qiáng)度的自動處理以用于隨后的數(shù)據(jù)解析。

9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(E)中獲得的數(shù)據(jù)的解析是通過比較墊中的熒光信號強(qiáng)度來進(jìn)行的，在所述墊中形成了匹配和錯配的雜交雙鏈體。

10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中解析結(jié)果可以用于利用存在一個或另一個作為標(biāo)記的突變來證實(shí)結(jié)核病的臨床診斷和進(jìn)行流行病學(xué)遺傳分型。

11.特異性引物對組，所述引物對組用于實(shí)現(xiàn)在臨床樣品中同時檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體和鑒定導(dǎo)致菌株對利福平和異煙肼產(chǎn)生抗性的分枝桿菌DNA突變的方法，其中所述引物的序列為SEQ?ID?NO：70-85。