[發(fā)明專利]一種液相蛋白芯片的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610122113.4
• 申請(qǐng)日: 2006-09-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101144815A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李明;陳瑋;吳英松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州市達(dá)瑞抗體工程技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/546
• 分類號(hào): G01N33/546;G01N33/545;G01N33/577
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

所屬技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種液相蛋白芯片的制備方法。

背景技術(shù)

生物芯片是上世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的一種生物檢測(cè)技術(shù)，其原理是在約1～2cm²大小的玻璃片、硅片、尼龍膜、凝膠或者金屬等支持介質(zhì)上，以微陣列的形式在不同位置固定上不同的生物分子探針(蛋白質(zhì)、核酸等)，這些探針?lè)肿涌梢耘c溶液中的目的分子相互作用(如雜交、抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)等)，反應(yīng)完成后通過(guò)洗片洗去未反應(yīng)的分子。目的分子可以事先標(biāo)記，也可以在與探針?lè)肿臃磻?yīng)后進(jìn)行染色，然后通過(guò)信號(hào)收集設(shè)備(如熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、芯片掃描儀等)檢測(cè)反應(yīng)信號(hào)的有無(wú)或強(qiáng)弱，經(jīng)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析后得到相關(guān)的生物信息。由于生物芯片高通量、高效率、并行化的特點(diǎn)，極大簡(jiǎn)化和縮短了實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)程，隨著人類基因組計(jì)劃提前完成和后基因組計(jì)劃啟動(dòng)，生物芯片迅速在生物學(xué)領(lǐng)域得到較廣泛的應(yīng)用。根據(jù)芯片表面固定的分子及檢測(cè)對(duì)象的不同，一般可將其分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和組織芯片幾類。雖然多數(shù)生物芯片的基片采用價(jià)格便宜的玻璃片，但是由于芯片制備需要專門(mén)的設(shè)備和技術(shù)、制備過(guò)程比較復(fù)雜、樣品的準(zhǔn)備與標(biāo)記較為繁瑣等多種因素，因而造成芯片的成本較高，而結(jié)果的重復(fù)性較差。另外，芯片使用過(guò)程是在基片的表面點(diǎn)加含有目的分子的溶液，目的分子需經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)距離的擴(kuò)散才能與探針在固-液相界面相互作用，因此反應(yīng)檢側(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，靈敏度有待進(jìn)一步提高。

1997年，一種兼具核酸和蛋白質(zhì)等生物分子分析功能的新一代高通量檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)誕生了，它就是由美國(guó)Luminex公司開(kāi)發(fā)出來(lái)的xMAP(flexible?Multi-Analyte?Profiling)技術(shù)，基于該技術(shù)的液相芯片(也稱為微球體懸浮芯片，suspension?array)是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新型生物芯片。它是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過(guò)紅、綠兩束激光分別檢測(cè)微球編碼和熒光信號(hào)來(lái)達(dá)到定性和定量的目的，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同生物學(xué)反應(yīng)。具體說(shuō)來(lái)，液相芯片體系由許多大小均一的圓形微球(microspheres，直徑為5.5～5.6μm)為主要基質(zhì)構(gòu)成，每一種微球都有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號(hào)，或稱光學(xué)編碼。在微球的制造過(guò)程中，按照精確的比例摻入了紅色和橙色兩種熒光染料(這兩種染料各有10種不同區(qū)分)，從而把微球分為100種不同的顏色，形成一個(gè)具有獨(dú)特光譜地址的含有100種不同微球的陣列。每種微球上可分別固定不同的探針?lè)肿樱绺鞣N蛋白、肽、多糖、脂類、寡核苷酸等生物分子，然后將這100種微球混合后懸浮于一個(gè)液相體系中，加入待測(cè)樣品，不同的探針可以和樣品中的不同目的分子結(jié)合，并使固定有探針的微球攜帶上報(bào)告分子藻紅蛋白(R-Phycoerythrin)。反應(yīng)結(jié)束后，儀器Luminex100可同時(shí)對(duì)100種微球上的100種分子進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。Luminex100是采用微流技術(shù)使微球快速單列通過(guò)檢測(cè)通道，并使用紅綠雙色激光同時(shí)對(duì)單個(gè)微球上的分類熒光和報(bào)告分子上的報(bào)告熒光進(jìn)行檢測(cè)。其中635nm紅色激光激發(fā)的是微球內(nèi)的紅色和橙色分類熒光分子，根據(jù)微球分類熒光信號(hào)強(qiáng)度的不同將微球分類，從而鑒定各個(gè)不同的反應(yīng)類型，即定性。綠色激光激發(fā)的是結(jié)合在微球表面上的橙色報(bào)告熒光分子，目的是確定微球上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量，即定量。因此，通過(guò)紅綠雙色激光的同時(shí)檢測(cè)，高速數(shù)字信號(hào)處理器將微球上的熒光信號(hào)強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的數(shù)字信號(hào)，就可以確定被結(jié)合的目的分子的種類和數(shù)量，完成對(duì)反應(yīng)的實(shí)時(shí)、定性和定量分析。

液相芯片技術(shù)與傳統(tǒng)免疫學(xué)、核酸檢測(cè)方法相比具有以下幾個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：

(1)高通量：從理論上說(shuō)，如果不存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)的通量等于微球的種類數(shù)，目前最多可達(dá)到100種。這遠(yuǎn)勝過(guò)一次只能檢測(cè)1個(gè)項(xiàng)目的傳統(tǒng)免疫分析法。

(2)樣本用量少：由于在同一個(gè)反應(yīng)孔中可以同時(shí)完成100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，所以檢測(cè)多指標(biāo)時(shí)大大節(jié)省了樣本用量，非常適合分析小體積稀有樣品。

(3)操作簡(jiǎn)單、快速：由于是基于液相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，因此反應(yīng)速度快，孵育時(shí)間比傳統(tǒng)的固相檢測(cè)短。進(jìn)行免疫學(xué)分析時(shí)，若使用高親和力抗體，2～3小時(shí)內(nèi)即完成檢測(cè)，而核酸雜交分析在PCR擴(kuò)增后1小時(shí)內(nèi)可得到結(jié)果。

(4)檢測(cè)范圍廣：可達(dá)3～5個(gè)數(shù)量級(jí)，樣品無(wú)需濃縮或稀釋。

(5)準(zhǔn)確性好：由于液相芯片技術(shù)的檢測(cè)范圍大，因此不需要象ELISA檢測(cè)中樣本需多倍稀釋，從而減小了誤差。